[发明专利]一株不产桔霉素的重组红曲菌及其构建方法

说明书

本发明提供了一株不产桔霉素的重组红曲菌——紫色红曲菌(Monascus purpureus)浙工红曲3号，由红曲霉A基因敲除桔霉素合成基因(pksCT)并去除外源基因后获得。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种不产桔霉素且不含外源基因的重组红曲菌，该重组紫色红曲菌在YES液体培养基中发酵15d后并未检测到桔霉素，为工业上红曲菌种改良提供了新的途径。

(一)技术领域

本发明涉及一株不产桔霉素且不含外源筛选基因的重组红曲菌及其构建方法。

(二)背景技术

红曲菌是我国重要的食用和药用微生物，可以产生多种天然产物，包括红曲色素、Monacolin K和γ-氨基丁酸等，其代谢产物被广泛应用于医药、食品等行业。但是大部分具有工业价值的红曲菌的发酵产品都可能含有一种对人体具有肝、肾毒性的真菌毒素—桔霉素，从而影响红曲产品的销售。

为了消除红曲菌制品中潜在的桔霉素，通过理化诱变筛选得到性状优良的红曲菌是一种方法；但是筛选的工作量大且工业价值不确定。也有研究者利用基因工程手段对红曲菌菌种进行定向改造，将桔霉素合成基因(pksCT)替换成真菌筛选标记基因，例如潮霉素抗性基因(hph)；改造后的红曲菌发酵液中桔霉素的含量明显下降，但是外源导入的基因仍保留在改造后的红曲菌基因组上。外源基因片段大都来源于亲缘关系较远的原核生物，使得重组红曲菌的安全性受到质疑。

外源基因清除技术可以实现筛选基因的清除，目前主要用于解决转基因植物的环境安全性和食品安全性问题。而在丝状真菌中则较难实现外源基因的清除：由于丝状真菌存在同源重组和非同源末端连接两种DNA双链缺口修复机制，导致在丝状真菌中实现靶向基因片段的同源重组效率很低。

(三)发明内容

本发明的目的是克服现有红曲菌基因组改造技术和红曲菌产生桔霉素的不足，提供一株桔霉素合成基因(pksCT)敲除且外源筛选基因清除的重组紫色红曲菌(Monascuspurpureus)。

本发明采用的技术方案是：

一株不产桔霉素的重组红曲菌——紫色红曲菌浙工红曲3号(Monascuspurpureus浙工红曲3号)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，分类名称为：Monascus purpureus，保藏编号为CCTCC NO：M 2020728，保藏日期为2020年11月12日。

该紫色红曲菌浙工红曲3号由红曲霉A基因敲除桔霉素合成基因(pksCT)并去除外源基因后获得。红曲菌A是一株从土壤中筛选得到的具有工业价值的菌株，本发明利用Cre-LoxP系统对红曲菌A桔霉素合成基因(pksCT)进行敲除，使得红曲菌基因组上不保留外源基因片段。Cre-loxP是一种特定位点的重组酶技术，可在DNA的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位，用该系统可以针对特定的细胞类型或采用特定的外部刺激，对细胞中DNA进行修改。

本发明还涉及一种构建所述重组红曲菌的方法，所述方法包括：

(1)以红曲菌A基因组为模板，分别设计引物进行PCR反应，扩增出pksCT基因的UTL核酸片段和UTR核酸片段：

(2)以根瘤农杆菌载体pPZP201为母核，与核酸替代片段WH连接得到pWH2双元载体，然后用XbaⅠ限制性内切酶酶切得到线性化pWH2载体；使用C112重组酶对线性化pWH2载体和UTL进行重组得到pWH2::UTL；SpeⅠ限制性内切酶酶切pWH2::UTL，使用C112重组酶对线性化载体和UTR进行重组得到pWH2::ΔpksCT；所述核酸替代片段WH依次包括以下序列：左LoxP序列、xyn1启动子、Cre酶序列、NOS终止子、hph序列和右LoxP序列；