[发明专利]一株不产桔霉素的重组红曲菌及其构建方法

权利要求书

1.一株不产桔霉素的重组红曲菌——紫色红曲菌浙工红曲3号(Monascus purpureus浙工红曲3号)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，分类名称为：Monascus purpureus，保藏编号为CCTCC NO：M 2020728，保藏日期为2020年11月12日。

2.一种构建权利要求1所述不产桔霉素的重组红曲菌的方法，所述方法包括：

(1)以红曲菌A基因组为模板，分别设计引物进行PCR反应，扩增出pksCT基因的UTL核酸片段和UTR核酸片段：

(2)以根瘤农杆菌载体pPZP201为母核，与核酸替代片段WH连接得到pWH2双元载体，然后用XbaⅠ限制性内切酶酶切得到线性化pWH2载体；使用C112重组酶对线性化pWH2载体和UTL进行重组得到pWH2::UTL；SpeⅠ限制性内切酶酶切pWH2::UTL，使用C112重组酶对线性化载体和UTR进行重组得到pWH2::ΔpksCT；所述核酸替代片段WH顺次包括以下序列：左LoxP序列、xyn1启动子、Cre酶序列、NOS终止子、hph序列和右LoxP；

(3)将重组载体pWH2::ΔpksCT转化到根瘤农杆菌AGL-1中，将含有重组载体pWH2::ΔpksCT的根瘤农杆菌AGL-1利用根瘤农杆菌介导的转化法转化红曲菌，潮霉素抗性平板上筛选转化子,在潮霉素抗性平板上不生长而在不含潮霉素抗性平板上生长的菌株进行PCR验证，验证成功的转化子即为所述重组紫色红曲菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述UTL核酸片段序列如SEQ ID NO.9所示，所述UTR核酸片段序列如SEQ ID NO.10所示。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述核酸替代片段WH序列如SEQ ID NO.11所示。