[发明专利]一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法

说明书

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用细菌非生长耦联特性生产β‑1,3‑葡聚糖的方法。所述方法包括以下步骤：将产β‑1,3‑葡聚糖菌株进行活化，制备种子培养液；将种子培养液接入发酵培养基中，进行发酵培养；发酵结束后，将60‑80%的发酵液转入转化罐内；向剩余20‑40%的发酵液中加入发酵培养基至初始发酵体积，再继续进行二次发酵，如此循环5‑6次；S4.向转化罐内分次流加糖液，进行全细胞转化。本发明方法通过高密度发酵培养和流加补糖全细胞转化的方式，可以显著提高β‑1,3‑葡聚糖产量，并缩短生产周期，降低生产成本，解决了现有发酵工艺的不足。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法。

背景技术

β-1,3-葡聚糖是一类主链由β-1,3-糖苷键连接而成的多聚糖，是天然无害的高分子物质，通常因来源不同而含有不同比例和大小的β-1,2/β-1,4/β-1,6-连接的支链。

β-1,3-葡聚糖具有能增强免疫活力、抗肿瘤、抗氧化、抗细菌、抗病毒、抗真菌、降低胆固醇、降血脂等生物活性，是一种良好的生物效应调节剂。同时，还具有保湿、抗炎、抗衰老、去皱、去头屑、退黄、加快修复、增加皮肤弹性等功效，广泛应用在医药、食品、化妆品、动物饲料添加剂等多个领域。

目前，β-1,3-葡聚糖主要来源于酵母、食用真菌和植物(如香菇、燕麦、青稞)，受限于技术的复杂和成本的高昂，β-1,3-葡聚糖主要为低纯度的粗产物，生产过程产生的副产物也较多，产量受原材料成本制约。利用微生物发酵生产β-1,3-葡聚糖，具有不受季节限制、原料来源稳定易得、过程无副产物产生、批次间质量稳定的优点。

可得然胶(Curdlan)是由根瘤菌属的细菌合成，以β-1,3-D-糖苷键连接成的水不溶性葡聚糖，工业生产采用间歇式发酵来获得，生产周期长，产量偏低，每个周期开始都需要进行发酵罐的空实消，蒸汽消耗量较大。

中国专利申请CN110241150Aβ-1，3-葡聚糖的放大发酵方法，包括以下步骤：第一步、制备菌种活化培养基，按照KH₂PO₄ 0.3-1.0g/L；CaCl₂ 0.3-1.0g/L，MgSO₄ 0.6-1.2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.6-1.2g/L，蔗糖3.0-8.0g/L，琼脂12.0-18.0g/L的质量浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调pH 6.5-7.0，115℃灭菌30分钟；第二步、菌种活化，将菌株划线接种于第一步所得菌种活化培养基，25-30℃静置恒温培养2-3天；第三步、制备种子培养液，按照蛋白胨8.0-10.0g/L，酵母浸粉3.0-5.0g/L，氯化钠3.0-5.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，115-121℃灭菌20-30分钟；第四步、培养种子液，从菌种活化培养基上刮取活化菌种转接到100mL液体种子培养液中，于28-32℃摇床中以150-300rpm的速度震荡培养48-72h，至培养液OD600值在0.6-0.9之间，作为初级发酵培养的种子液备用；第五步、制备初级发酵培养液，按照蛋白胨8.0-10.0g/L，酵母浸粉3.0-5.0g/L，氯化钠3.0-5.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，115-121℃灭菌20-30分钟；第六步、培养放大发酵种子液，按照种子液∶初级发酵培养液(V/V)比1∶300-800的比例，将种子液接种到初级发酵培养液中，于发酵罐25-35℃，发酵1-2天，调pH 6.5-7.0，搅拌速率150-200rpm，通气量0.4-0.5vvm，至发酵培养液OD600值大于0.9，作为放大发酵培养的种子液备用；第七步、制备放大发酵培养液，按照蔗糖120g/L的质量浓度称取，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；第八步、放大发酵培养，按照初级发酵培养液∶放大发酵培养液(V/V)比1∶300-800的比例，将初级发酵液接种到放大发酵培养液中，于发酵罐25-35℃，发酵5-9天，其中发酵第1-2天需控制pH为7.0，误差不超过±0.1，搅拌速率为150-200rpm，通气量为0.4-0.5vvm；定时取样检测，待氮源耗尽时，调pH至5.5，误差不超过±0.1，搅拌速率为400-600rpm，通气量为0.7-0.8vvm，最终获得β-1，3-葡聚糖粗品。该方法得β-1，3-葡聚糖粗品最高产量为49.7mg/mL。该方法步骤复杂且所得β-1，3-葡聚糖产量较低。