[发明专利]两种多功能基因编辑工具的构造及其使用方法

说明书

本发明公开了两种人类基因组编辑工具的构建和使用方法。两种人类基因组编辑工具都由一种RTgRNA分子及对应的基因编辑融合蛋白结合而成。每种融合蛋白主是由一种改造过的Cas蛋白和改造过的逆转录酶连接而成。每种编辑器都可更改人类细胞基因组DNA。改变DNA的方式包括短片段删除、增加、替换DNA碱基。两种基因组编辑工具具有超高精准性，期望产物纯度高，对细胞伤害极低，拓展性强，能实现多种编辑，设计较容易，成本较低，能多位点同时编辑等特点。

技术领域

本发明属于分子生物学领域的基因组编辑技术一类，具体涉及两种基因组修改工具的构建、制备方法。每种基因组修改工具都可以在一种特殊设计的RNA的指导下，定位到人类基因组上指定靶点，进行DNA的插入，删除，多碱基突变。

背景技术

本专利的基因编辑器是能和碱基编辑器对标的人类基因组超精准编辑器。首先，这种编辑器可以做12种碱基对的转换，碱基编辑器只能做4种碱基对的改变。第二，碱基编辑器不能插入或者删除人为设计的小片段DNA(大约1～100bp)到指定的编辑位点，然而本专利的技术可以做到。

第三，专利中的基因组编辑器根据专利中所述的方法，可以实现人类细胞多位点，超精准，在打靶区域内，一个或多个碱基的转换，或者多个位点的删除和插入。为了方便理解，可以表达多位点不定量任意碱基转换(Multiplexing single-or-more arbitrarybase conversion，MSMABC for short)，简称MSMABC。以及多位点短片段DNA插入或删除(Multiplexing short insertion-or-deletion，MSI for short)，简称MSID。碱基编辑器从原理上来说可以做到多个不同位点的碱基转换，但做不到在多个打靶区任意碱基同时替换。碱基编辑器也没办法做到在打靶区做短片段DNA的插入和删除，更不用说多靶点短片段的DNA的插入和删除了。HDR介导的相关编辑，操作起来很麻烦，而且实际效率很低。

第四，本专利中的所阐述的两种基因编辑策略是可以通过本专利中的基因编辑器来实现的。其他任何基因编辑工具都不具备能够实现本专利中提到的“耦连写入”、“逻辑写入”的潜力。原因之一是：这两个基因组编辑策略是为本专利中的编辑工具特别设计的。两种编辑策略极大的拓展了基因编辑器的基因编辑效率。耦连写入和逻辑写入主要是提升基因编辑效率，并且实现基因编辑区多碱基同时替换。

发明内容

定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸和蛋白质化学、分子生物学、细胞学，相关术语和实验室操作步骤均为相应领域广泛使用的术语和常规步骤。

“电转化”或“电穿孔(electroporation)”是可以互相使用的专业术语，指的是运用电脉冲在细胞表面瞬时产生纳米尺度的孔洞，为细胞外的DNA、RNA、蛋白质，无机物大分子创造入口，使得细胞外的DNA、RNA、蛋白质、无机物大分子能够进入到细胞内的物理方法。该方法可递送本专利的基因组编辑工具到人类，小鼠，猴子，黑猩猩等真核细胞里。具体设备主要是ThermoFisher Scientific公司生产的NeonTM Transfection System和Lonza公司提供的NucleofectorTM Technology。具体操作和优化参考两公司的技术手册。就本专利而言无论电转化系统中的试剂盒、培养基怎么变，电穿孔的设备主要是Neon TransfectionSystem和Nucleofector Technology两系统里面涉及的设备。