[发明专利]两种多功能基因编辑工具的构造及其使用方法

权利要求书

1.递送本专利的两种人类基因组编辑工具到人类和其他哺乳动物细胞的方式包括；电转化或电转孔(electroporation)递送法；纳米粒子递送，特别是脂质体(liposome)，脂质纳米粒子(lipid nanoparticle)，多聚合物纳米粒子(polymer nanoparticle)和脂质多聚合纳米粒子(lipid-polymer hybrid nanoparticle)；病毒载体递送，特别是第二代或第三代自失活的慢病毒载体系统(the 2^ndor 3^rdgeneration of self-inactivatinglentivirus)，逆转录病毒系统。

2.如权利要求1所述的递送方法，递送到细胞中的人类基因组编辑工具可以是表达SEQID NO.1，SEQ ID NO.2氨基酸链的DNA分子、mRNA分子，RNA和融合蛋白混合物。

3.如权利要求1所述，电转化或电穿孔所用的设备包括4D-Nucleofector^TM(Lonza)和Neon^TM nucleofection(ThermoFisher Scientific)系统。

4.如权利要求1所述，每种基因组编辑工具都由一种融合蛋白和对应的RTgRNA构成，每种融合蛋白包含以下一条或者多条特征：

i.整个融合蛋白由改造过的Cas蛋白(以下简称为Cas)和改造过的逆转录酶(以下简称为RT)两个必要蛋白构成，改造过的Cas可以是改造过的SaCas9或改造过的CjCas9；

ii.整个融合蛋白的N端(简称为N-term)或者C端(简称为C-term)，至少一端拥有一个核定位信号(以下简称为NLS)；

iii.整个融合蛋白含有一段由甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的GS linker氨基酸链，无论GS linker区怎样加入其它氨基酸或者改变氨基酸的排列方式，linker本生由甘氨酸加丝氨酸构成，其长度在20到400个氨基酸以内，G加S在整个GS linker的比例在50％～100％之间，GS linker主要放到Cas和RT之间；

iv.改造过的Cas和改造过的RT从N-term到C-term的组合顺序可以是：Cas-RT，也可以是RT-Cas。

5.如权利要求4所述，每种基因组编辑工具由一种融合蛋白和对应的RTgRNA构成，

i.与含有SaCas9的融合蛋白搭配的RTgRNA称作SRTgRNA，SRTgRNA的结构模式是：5’-template-RBS-flexible linker-gRNA-gRNA scaffold-3’或3’-gRNA-gRNA scaffold-template-RBS-5’：

ii.与含有CjCas9的融合蛋白搭配的RTgRNA称作CRTgRNA，CRTgRNA的结构模式是：5’-template-RBS-flexible linker-gRNA-gRNA scaffold-3’或3’-gRNA-gRNA scaffold-template-RBS-5’。

6.如权利要求1所述，利用基因编辑工具实现本专利中定义的基因编辑策略包括本专利中定义的：“耦连写入”、“逻辑写入”。