[发明专利]一种模板多核苷酸配对末端测序方法、试剂盒

说明书

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种模板多核苷酸配对末端测序方法、试剂盒。本发明对用于产生互补链的延伸引物进行特殊设计，形成至少由第一延伸引物、第二延伸引物连接为一体的延伸引物结构，并设计第一延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点位于第二延伸引物结合位点的上游。在具有链置换活性的环境下，上游延伸引物的延伸链置换下游延伸引物的延伸链，被置换的下游延伸引物的延伸链通过第二延伸引物连接在第一延伸引物上，再通过第一延伸引物的延伸链结合在模板多核苷酸链上，再通过模板多核苷酸链固定在固体支持物上，提高互补链在循环测序环境中的稳定性，提高测序质量。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种模板多核苷酸配对末端测序方法、试剂盒。

背景技术

配对末端或成对测序技术在分析生物学领域是公知的，配对末端测序允许确定来自一条多核苷酸双链两个位置的序列的两个读取。由于配对末端序列并非是完全随机的，而是已知发生在单个双链上，在基因组中是相连或成对的，有助于将全基因组的序列组合成一致的序列，提高一次测序获得的序列信息的长度。

现有技术中公开的基于阵列多核苷酸模板的配对末端测序方法包括，WO2004/070005中公开的在固体支持物上实施的，将两个或多个引物同时与靶多核苷酸杂交，在杂交步骤之后，除一个引物之外，封闭其他所有与模板杂交的引物，未被封闭的引物进行延伸测序，完成测序之后，被封闭引物中的一个解除封闭以得到游离3’羟基进行另一个延伸测序反应。该方法实施过程中虽然阵列的多核苷酸模板始终连接在固体支持物上，保持多核苷酸模板链的稳定性，但是必须要确保只有一个引物可延伸，其他引物必须完全封闭，在实际操作过程中很难确保其他引物的完全封闭，导致高的测序错误率；

WO2007010252公开了在固体支持物上形成双链模板簇，将双链模板簇变性形成单链簇，去除部分双链模板簇的其中一条链，对剩余的一条链进行测序；完成一次测序后，对剩余部分双模板簇中的与一次测序中序列相同的单链模板去除，对剩余的与该去除的模板链互补的链进行测序，完成双链模板的双末端测序。该方法一次只能对一部分簇的一条链进行测序，不能完全利用所有的簇，导致测序信号强度达不到预期；

WO2008041002公开了首先对全部的双链模板簇的其中一条链去除，对剩余的链测序，然后再以剩余的链为模板扩增形成其互补链，对其互补链进行测序，最终实现双末端测序；并具体公开了互补链的形成依赖固体支持物模板上设置的与第一次测序链的3端互补杂交的接头引物，并且该方法也依赖于首先形成双链模板簇，限制了该方法的应用范围。由此需要改进互补链的生成方式，使方法的实施应用不依赖于双链模板簇，也不依赖于固体支持物上特别设置的特殊接头，扩大双末端测序方法的应用范围。

例如，WO2016/133764公开了基于链置换原理生成互补链实现双末端测序的方法，通过第一引物与模板链杂交延伸形成于模板链互补的第二链，第二引物与模板链杂交延伸形成第三链的同时置换出第二链，控制第二链的置换，确保第二链在3端与模板链的部分互补杂交，形成部分与模板链杂交，部分悬伸的第二链，对第二链悬伸部分进行测序。该方法实施过程中，对形成的互补链（第二链）的固定是通过第二链靠近3端的部分与模板链部分互补杂交，该固定方式稳定性相对比较差，在延伸测序的反复循环冲洗的过程中容易脱落，降低测序信号，影响测序质量。鉴于此，需要进一步改进生成的互补链的固定方式，提高互补链在循环测序反应中的稳定性。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种多核苷酸模板配对末端测序方法，提高第二末端测序实施过程中形成的互补链的稳定性，提高测序质量。

同时，本发明还在于提供一种实施本发明测序方法的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种模板多核苷酸配对末端测序方法，包括以下操作步骤：

S1、提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸簇，加入第一测序引物，对单链模板多核苷酸至少部分序列进行测序，获得第一测序引物的延伸多核苷酸链和对应的第一末端序列信息；