[发明专利]一种模板多核苷酸配对末端测序方法、试剂盒

权利要求书

1.一种模板多核苷酸配对末端测序方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

S1、提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸簇，加入第一测序引物，对单链模板多核苷酸至少部分序列进行测序，获得第一测序引物的延伸多核苷酸链和对应的第一末端序列信息；

S2、去除第一测序引物的延伸多核苷酸链，加入延伸引物；其中延伸引物包括连接为一体的第一延伸引物和第二延伸引物，模板多核苷酸上具有第一延伸引物的结合位点和第二延伸引物的结合位点；其中第一延伸引物的结合位点位于第二延伸引物结合位点的上游；

S3、将延伸引物与模板多核苷酸退火杂交，在具有链置换反应活性的环境下，第一延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第一延伸链，第一延伸链至少部分置换第二延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第二延伸链，第二延伸链存在至少部分不与模板多核苷酸杂交结合，称为第二延伸链的悬伸部分；

S4、加入第二测序引物对第二延伸链的悬伸部分进行测序，获得对应的第二末端序列信息，完成模板多核苷酸的配对末端测序。

2.如权利要求1所述的模板多核苷酸配对末端测序方法，其特征在于，所述延伸引物还包括与第一延伸引物和第二延伸引物连接为一体的第三延伸引物，第三延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第一延伸引物相同；步骤S3中延伸引物至少与两条并列的单链模板多核苷酸杂交结合，第三延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第三延伸链至少部分置换第二延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第二延伸链。

3.如权利要求2所述的模板多核苷酸配对末端测序方法，其特征在于，所述延伸引物还包括与第一延伸引物、第二延伸引物、第三延伸引物连接为一体的第四延伸引物，第四延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第二延伸引物相同；步骤S3中延伸引物至少与两条并列的单链模板多核苷酸杂交结合，第三延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第三延伸链至少部分置换第四延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第四延伸链。

4.如权利要求1~3任一项所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，结合位点在上游的延伸引物的Tm值低于结合位点在下游的延伸引物的Tm值，结合位点在上游的延伸引物与结合位点在下游的延伸引物的Tm值差值为5~10℃。

5.如权利要求1~3任一项所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，步骤S3中上游结合位点的延伸引物产生的延伸链完全置换下游结合位点的延伸引物产生的延伸链，被置换出的延伸链不与模板多核苷酸杂交结合，完全悬伸。

6.如权利要求1~3任一项所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，所述单链模板多核苷酸包括第一衔接子、第二衔接子以及插入在第一衔接子和第二衔接子之间的靶DNA序列。

7.如权利要求6所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，第一衔接子包括第一测序引物结合位点、延伸引物结合位点；第二测序引物与第二衔接子的至少部分序列相同。

8.如权利要求7所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，所述第二衔接子还包括将模板多核苷酸固定在固体支持物上的元件。

9.如权利要求7所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，所述第一衔接子和第二衔接子还包括标签序列。

10.如权利要求1~3任一项所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，所述第一测序引物和第二测序引物的序列相同。

11.如权利要求1~3任一项所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，所述第一测序引物和第二测序引物的序列不同。