[发明专利]检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法、试剂盒

说明书

本发明涉及酶活分析技术领域，具体涉及一种检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法、试剂盒。本发明通过设计5’端和3’端均为磷酸修饰的核酸链作为反应底物，由于5’端已提前设置磷酸修饰结构，阻止待测T4多聚核苷酸激酶的5’磷酸化活性，使整个检测过程中仅发生3’去磷酸化反应，获得5’端为磷酸修饰、3’端为羟基的核酸链反应产物，通过检测反应一定时间后，反应混合液中反应产物和反应底物的含量关系，以单位时间内反应底物转化为反应产物的转化率定义T4多聚核苷酸激酶的去磷酸化活性。整个检测方法，操作简便，易于控制。

技术领域

本发明涉及酶活分析技术领域，具体涉及一种检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法、试剂盒。

背景技术

T4多聚核苷酸激酶，简称T4PNK，是由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初是从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的，因此又叫做T4多核苷酸激酶。该酶可以催化ATP的γ-磷酸向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3’磷酸基团的单核苷酸的5’羟基转移。该酶还具有3’磷酸酶活性，将3’-磷酸基团从寡核苷酸的3’磷酸末端、脱氧3’-单磷酸核苷和脱氧3’-二膦酸核苷上水解下来，形成3’-羟基结构。

T4PNK应用广泛，如寡核苷酸、DNA或RNA的5’末端标记，用作Sourthern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5’端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化3’磷酸化的单核苷酸的5’磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3’末端连接；去除3’端磷酸基团。

T4PNK生产过程中，通常需要对T4PNK的活性进行评价判断，包括5’端磷酸化活性和3’端去磷酸化活性。目前存在一些方法对T4PNK的5’端磷酸化活性进行分析检测，比如利用放射性同位素的[γ-33P]ATP掺入法；专利CN104293929A公开了一种能够与ATP发生氧化反应生产氧合荧光素，产生化学发光的荧光素酶报告基团系统的方式检测T4PNK的5’磷酸化活性；专利CN108823280A公开了基于银纳米簇荧光探针（通过使用无标记的、“turn-off”型荧光探针）的T4多聚核苷酸激酶活性检测方法。

上述T4PNK酶活检测方法均是针对T4PNK的5’端磷酸化的活性进行检测，缺乏简单高效准确检测T4PNK3’端去磷酸化活性的分析方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法，通过设计5’和3’端均带有磷酸基团的引物探针为底物，加入待测T4多聚核苷酸激酶反应，获得5’为磷酸基团、3’端为羟基的核酸链产物，通过测定底物和产物的含量关系，进而推导出T4多聚核苷酸激酶的去磷酸化活性，操作简便，易于控制。

同时，本发明的目的还在于提供一种检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法，包括在反应缓冲液中依次加入反应底物和待测T4多聚核苷酸激酶，检测反应完成后的反应混合液中反应底物和反应产物的含量关系，推导出T4多聚核苷酸激酶的去磷酸化活性；

其中反应底物为5’端和3’端均为磷酸修饰的核酸链；反应产物为5’端磷酸修饰、3’端为羟基的核酸链。

进一步的，上述检测反应混合液中反应底物和反应产物的含量关系的方法为：采用HPLC检测，反应底物和反应产物保留时间不同，根据反应底物和反应产物对应的峰面积的比例，推导出T4多聚核苷酸激酶的去磷酸化活性。

为了进一步提高检测结果的准确性，反应底物序列中核苷酸A和核苷酸T的总含量为70%，核苷酸A和核苷酸T的含量比例为1：1；更进一步的，反应底物序列中不含有核苷酸G。