[发明专利]检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法、试剂盒

权利要求书

1.一种检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法，其特征在于，包括在反应缓冲液中依次加入反应底物和待测T4多聚核苷酸激酶，检测反应完成后的反应混合液中反应底物和反应产物的含量关系，推导出T4多聚核苷酸激酶的去磷酸化活性；

其中反应底物为5’端和3’端均为磷酸修饰的核酸链；反应产物为5’端磷酸修饰、3’端为羟基的核酸链。

2.如权利要求1所述的检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法，其特征在于，检测反应混合液中反应底物和反应产物的含量关系的方法为：采用HPLC检测，反应底物和反应产物保留时间不同，根据反应底物和反应产物对应的峰面积的比例，推导出T4多聚核苷酸激酶的去磷酸化活性。

3.如权利要求2所述的检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法，其特征在于，反应底物序列中核苷酸A和核苷酸T的总含量为70%，核苷酸A和核苷酸T的含量比例为1：1。

4.如权利要求3所述的检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法，其特征在于，反应底物序列中不含有核苷酸G。

5.如权利要求4所述的检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法，其特征在于，反应底物序列组成为：5’-P-CATTATTATCACCCATAAC-P-3’；反应产物序列组成为：5’-P-CATTATTATCACCCATAAC -3’。

6.如权利要求5所述的检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法，其特征在于，HPLC分析条件为：采用Poroshell 5μM 300SB-C18 2.1*75mm色谱柱；流动相：A：0.1M TEAB；B：0.1M TEAB中体积含量为30%的乙腈溶液；

流动相流速为0.5ml/min；流动相洗脱为梯度洗脱：0~15min：90%A、10%B；15~20min：40%A、60%B；20~25min：90%A、10%B；

HPLC分析条件为：波长260nm；柱温30℃；采用DAD检测器、220-400nm全波段扫描模式。

7.如权利要求1~6任一项所述的检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法，其特征在于，还包括将反应混合液离心后取上清液检测反应底物和反应产物的含量关系；离心为12000rpm离心20min。

8.如权利要求1~9任一项所述的检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的方法，其特征在于，所述反应完成包括在37℃条件下反应20~30min，终止反应；

其中终止反应的方法包括加入EDTA终止反应或者热处理使T4多聚核苷酸激酶失活去磷酸化活性；热处理的加热温度为65℃，热处理时间为20min；

反应缓冲液为70mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、5mM DTT。

9.一种检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的试剂盒，其特征在于，包括反应底物试剂；反应底物为5’端和3’端均为磷酸修饰的核酸链。

10.如权利要求9所述的检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的试剂盒，其特征在于，反应底物的序列组成为5’-P-CATTATTATCACCCATAAC -P-3’ 。

11.如权利要求10所述的检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的试剂盒，其特征在于，反应底物试剂的终浓度为2μM。

12.如权利要求9~11任一项所述的检测T4多聚核苷酸激酶去磷酸化活性的试剂盒，其特征在于，还包括酶反应缓冲液；所述酶反应缓冲液为70mM Tris-HCl、10mM MgCl₂ 、5mMDTT pH7.6。