[发明专利]一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：从健康胎盘上剥离羊膜并进行清洗，随后剪成小块，得到羊膜样品；将羊膜样品置于胶原酶I溶液中进行消化并去除消化液，再进行清洗，得到消化样品；将消化样品置于胰蛋白酶溶液中进行酶解、分离，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清终止酶解、过150目筛，收集滤液；将滤液进行离心、过滤，再添加DMEM培养基进行重悬，得到胎盘亚全能干细胞种子；将胎盘亚全能干细胞种子进行原代培养，得到原代胎盘亚全能干细胞；将原代胎盘亚全能干细胞接种至传代培养基中进行传代培养，得到传代胎盘亚全能干细胞，并进行冷冻保存；该方法得到的干细胞具有较高的纯度和得率，且增殖快，活性高。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法。

背景技术

胎盘(placenta)是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘还合成多种激素、酶和细胞因子等，以维持正常妊娠。胎盘还是一味中药，称之为紫河车，又叫人胎衣、胞衣、衣胞、胎衣、胎膜。

然而，胎盘中年可以分离出大量胎盘亚全能干细胞，其发育阶段与胚胎干细胞接近，具备全能干细胞的生物学特征，可以定向分化成上皮干细胞、神经干细胞、心肌细胞、骨细胞等等。

现有胎盘亚全能干细胞的分离方法大多包括羊膜处理、酶解和离心，但现有分离方法分离得到的胎盘亚全能干细胞中存有杂细胞较多，导致纯度较低，而且由于消化不彻底，导致得率较低。

此外，分离得到的胎盘亚全能干细胞需要经过培养扩增得到足够的胎盘亚全能干细胞，然而，随着胎盘亚全能干细胞的扩增代数的增加，导致胎盘亚全能干细胞的活力、分化能力降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，该分离培养方法分离得到的胎盘亚全能干细胞具有较高的纯度和得率；而且具有增值快和较高的分化活力。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明实施例第一方面提供一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，所述分离培养方法包括如下步骤：

(a)从健康胎盘上剥离羊膜，并采用生理盐水对羊膜进行清洗，随后将羊膜剪成1～4mm³的小块，得到羊膜样品；

(b)将羊膜样品置于胶原酶I溶液中进行消化并去除消化液，再采用生理盐水进行清洗，得到消化样品；

(c)将消化样品置于胰蛋白酶溶液中进行酶解、分离，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清终止酶解、过150目筛，收集滤液；

(d)将滤液进行离心、过滤，再添加DMEM培养基进行重悬，得到胎盘亚全能干细胞种子；

(e)将胎盘亚全能干细胞种子进行原代培养，得到原代胎盘亚全能干细胞；

(f)将原代胎盘亚全能干细胞接种至传代培养基中进行传代培养，得到传代胎盘亚全能干细胞，并进行冷冻保存。

优选地，所述胶原酶I溶液中胶原酶I的浓度为1～2mg/ml。

优选地，所述消化温度为37℃，消化时间为10～20min。

优选地，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶浓度为0.2％。

优选地，所述酶解温度为37℃，酶解是时间为30～40min。

优选地，所述原代培养包括：