[发明专利]一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)从健康胎盘上剥离羊膜，并采用生理盐水对羊膜进行清洗，随后将羊膜剪成1～4mm³的小块，得到羊膜样品；

(b)将羊膜样品置于1.5mg/ml的胶原酶I溶液中，并在37℃下消化15min，随后去除消化液，再采用生理盐水进行清洗，得到消化样品；

(c)将消化样品置于0.2％的胰蛋白酶溶液中，并在37℃下酶解35min，然后，分离，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清终止酶解、过150目筛，收集滤液；

(d)将滤液以2000rpm转速进行离心、过滤，再向沉淀物中添加DMEM培养基进行重悬，得到胎盘亚全能干细胞种子；

(e)将胎盘亚全能干细胞种子以1×10⁴的密度接种于原代培养基上，置于二氧化碳体积分数为5％、温度为37℃条件下进行细胞培养，第2天进行换液，然后间隔2天换液，待细胞长至80％～90％汇合度，收获得原代胎盘亚全能干细胞；

(f)采用传代培养基悬浮原代胎盘亚全能干细胞，并以2200cell/cm²的接种密度接种于滚瓶中，在25r/min转速下进行培养，间隔两天更换传代培养基，待细胞融合至80％～90％，得到传代胎盘亚全能干细胞，并进行冷冻保存；

其中，传代培养基为包括浓度为3g/ml的人血白蛋白、3g/ml的转铁蛋白、0.3ng/ml的亚油酸、0.3ng/ml的碱性成纤维生长因子、0.8ng/ml的人血小板源生长因子和0.9ng/ml表皮生长因子的DMEM培养基。