[发明专利]一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。本发明构建了适用于植物内生真菌露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体，并对新型单端孢霉烯的关键生物合成基因Tri18进行敲除，并通过代谢产物对比分析进一步验证目的基因的功能，为后期解析露湿漆斑菌A553中单端孢霉烯trichothecenes生物机合成制奠定分子生物学基础，促进trichothecenes类化合物在抗肿瘤药物先导化合物方面的开发利用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

背景技术

露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553是一种来源于药用植物广藿香的内生真菌，露湿漆斑菌是大豆的主要致病真菌，对大豆产量造成了不可估量的损失。据报道单端孢霉烯毒素是一种含有大环内酯结构的倍半萜类化合物，具有显著的细胞毒活性，是露湿漆斑菌的毒力因子。本课题组前期从露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553中分离得到了多种具有显著细胞毒活性的单端孢霉烯类化合物，其中部分化合物具有一定的特异性抗肿瘤活性，具有开发成为特异性抗肿瘤药物先导化合物的潜力。在此基础上，本课题组对M.roridum A553进行了转录组及基因组测序，从中发掘了单端孢霉烯的生物合成基因簇。从中发掘了单端孢霉烯生物合成的相关基因Tri18，预测其编码的酰基转移酶在大环单端孢霉烯骨架形成过程中发挥重要作用，但其如何通过生物合成生成D型大环单端孢霉烯仍需进一步解析。因此，建立M.roridum A553的基因敲除体体系对于验证单端孢霉烯的生物合成关键基因，进而解析其生物合成机制至关重要。

CRISPR/Cas9是近年来兴起的由sgRNA骨架介导Cas9核酸酶对靶向基因切割，通过非同源末端修复和同源重组途径使目的基因发生突变或缺失从而使目的基因失活的技术。研究者们不断发掘了nCa9和Cas12a等技术以提高CRISPR/Cas9的特异性和基因编辑效率。激活诱导性胞苷脱氨酶与CRISPR/Cas9结合可使碱基C变为T，从而使编码基因突变或失活，这比通过基因突变和基因删除具有更高的效率。CRISPR/Cas9系统由于构建简单，基因敲除效率相对较高，成本较低等优点已经在哺乳动物细胞、干细胞和植物等真核细胞的基因组编辑方面有着十分广泛的应用，而由于植物内生真菌独特生境导致及相对复杂的遗传背景，且CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中敲除效率相对较低，目前CRISPR/Cas9系统尚未应用于露湿漆斑菌M.roridum A553目的基因敲除。

发明内容

本发明的目的在于克服目前露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553缺乏有效的遗传操作手段的现状，提供一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

本发明的第一个目的是提供一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：

在pFC332载体基础上，设计Tri18基因的靶点序列5'-GGGTGAAGATGGCGATTGTT-3'，设计并分别扩增5S rRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5S rRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段为混合模板进行融合PCR，得到5S rRNA-Tri18-sgRNA片段；

用限制性内切酶PacI和BglII双酶切pFC332载体和5SrRNA-Tri18-sgRNA片段，然后用T4 DNA连接酶将5S rRNA-Tri18-sgRNA片段连接至pFC332载体中，连接产物转化至Trans5α感受态细胞，Amp抗性筛选，扩增5S rRNA-Tri18-sgRNA片段进行菌液PCR验证，由此获得适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体。

优选，所述的5S rRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的含靶点序列的sgRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。