[发明专利]一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 202011538861.7 | 申请日： | 2020-12-23 |
| 公开（公告）号： | CN112538496A | 公开（公告）日： | 2021-03-23 |
| 发明（设计）人： | 叶伟;章卫民;朱牧孜;岑由飞;李赛妮;刘洪新;李浩华 | 申请（专利权）人： | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） |
| 主分类号： | C12N15/80 | 分类号： | C12N15/80;C12N15/113;C12N1/15;C12R1/645 |
| 代理公司： | 广州科粤专利商标代理有限公司 44001 | 代理人： | 朱双;刘明星 |
| 地址： | 510070 广东省广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 适用于 露湿漆斑菌 a553 crispr cas9 载体 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
在pFC332载体基础上，设计Tri18基因的靶点序列5'-GGGTGAAGATGGCGATTGTT-3'，设计并分别扩增5S rRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5S rRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段为混合模板进行融合PCR，得到5S rRNA-Tri18-sgRNA片段；
用限制性内切酶PacI和BglII双酶切pFC332载体和5SrRNA-Tri18-sgRNA片段，然后用T4 DNA连接酶将5S rRNA-Tri18-sgRNA片段连接至pFC332载体中，连接产物转化至Trans5α感受态细胞，Amp抗性筛选，扩增5S rRNA-Tri18-sgRNA片段进行菌液PCR验证，由此获得适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的5S rRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的含靶点序列的sgRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种根据权利要求1或2所述的构建方法构建得到的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体。
4.一种含有权利要求3所述的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体的真菌。
5.根据权利要求4所述的真菌，其特征在于，所述的真菌为露湿漆斑菌A553。
6.权利要求3所述的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体在露湿漆斑菌A553基因敲除中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将所述的适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体通过原生质体介导法导入露湿漆斑菌A553原生质体，用含有潮霉素的PDA平板筛选，挑取阳性克隆并提取基因组DNA扩增Cas9基因验证重组载体的导入，并通过测序验证目标基因的敲除。
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