[发明专利]一种桑树花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶基因的克隆方法及其应用

说明书

本发明公开了一种桑树花青素‑3‑O‑葡萄糖苷‑2‑O‑葡萄糖醛酸转移酶基因的克隆方法及其应用，所述克隆方法包括以下步骤：桑树供试样本总RNA提取及cDNA第一链的合成；桑树MaUGAT基因的克隆。本发明还公开了所述方法克隆的桑树花青素‑3‑O‑葡萄糖苷‑2‑O‑葡萄糖醛酸转移酶基因在桑椹种质培育过程中的应用。本发明从川桑基因组数据库比对并鉴定到1个花青素‑3‑O‑葡萄糖苷‑2‑O‑葡萄糖醛酸转移酶基因，通过设计特异性引物从粤椹大10的桑椹中克隆到该基因，本发明丰富了桑椹甚至桑科植物中的相关数据，为桑树遗传改良提供候选基因，促进桑椹品质提升，更好地为果桑产业化服务。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种桑树花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶基因的克隆方法及其应用。

背景技术

花青素(Anthocyanin)是决定植物花、果实和种子等颜色的重要色素之一，属黄酮多酚类化合物。近年来，大量研究发现花青素具有抗炎症、抗肿瘤、调节血脂等多种生物学活性，表明其在植物抗逆和预防人类慢性疾病中可起到重要作用。由于桑椹花青素含量较高，因此现在对桑椹花青素的开发与利用正成为热点，然而关于桑树花青素生物合成途径及机制的研究还较少。花青素生物合成属于类黄酮生物合成途径的一部分，该途径包含基因数量多且功能复杂，由于不同基因的表达具有差异性，因此即存在协同，也存在竞争，致使代谢产物并非花青素这一种。

Shinya S等在红雏菊(Bellis perennis)的花青素生物合成途径中鉴定到一个花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶(BpUGAT)基因，定量PCR分析表明，BpUGAT基因的转录产物可以在红色花瓣中特异性地检测到，与植物体内酶活性的时空分布相一致，功能分析证实其催化葡萄糖醛酸糖基从UDP-葡萄糖醛酸向花青素3-O-6″-O-丙二酰葡萄糖苷的3-葡萄糖基部分的2″-羟基上转移，表明UGAT基因处于UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(UFGT)的下游。研究表明，花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶(UGAT)催化花青素-3-O-葡萄糖苷转化为花青素3-O-(2-O-β-D-葡萄糖醛酸基)-β-D-葡萄糖苷，最终形成稳定的花色苷物质。因此，花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶可能参与调控桑椹中花青素的代谢过程，表明这其在花青素积累过程中具有重要的调节作用。但目前还未有关于桑树花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶(MaUGAT)基因的克隆和应用研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桑树花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶基因的克隆方法及其应用。

其技术方案如下：

一种桑树花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶基因的克隆方法，包括以下步骤：

步骤1、桑树供试样本总RNA提取及cDNA第一链的合成

粤椹大10的桑椹样本用液氮研磨成粉末，按照试剂盒标准抽提步骤提取样本总RNA，采用Nano Drop2000微量分光光度计来检测总RNA提取质量，计算OD260/OD280的比值，当比值为1.8-2.2左右时，表明总RNA提取的质量较好。按照第一链cDNA合成试剂盒操作流程配置20μL反应体系，反转录合成cDNA第1链。

步骤2、桑树MaUGAT基因的克隆

参考红雏菊(BpUGAT)基因序列，上传至川桑基因组数据库(https://morus.swu.edu.cn/morusdb/)进行序列比对，与它相似率最高的是Morus016781基因，即桑树(MaUGAT)基因，根据该基因序列设计特异性引物，引物序列如SEQ:ID:NO:1-SEQ:ID:NO:2所示；