[发明专利]一种桑树花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶基因的克隆方法及其应用

权利要求书

1.一种桑树花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、桑树供试样本总RNA提取及cDNA第一链的合成

粤椹大10的桑椹样本用液氮研磨成粉末，按照试剂盒标准抽提步骤提取样本总RNA，采用Nano Drop2000微量分光光度计来检测总RNA提取质量，计算OD260/OD280的比值，比值为1.8-2.2；按照第一链cDNA合成试剂盒操作流程配置20μL反应体系，反转录合成cDNA第1链；

步骤2、桑树MaUGAT基因的克隆

参考红雏菊BpUGAT基因序列，上传至川桑基因组数据库https://morus.swu.edu.cn/morusdb/进行序列比对，与它相似率最高的是Morus016781基因，即桑树MaUGAT基因，根据该基因序列设计特异性引物，引物序列如SEQ:ID:NO:1-SEQ:ID:NO:2所示；

以粤椹大10样本混合cDNA为模板进行PCR扩增，扩增反应体系25μL为:10×PCR buffer2.5μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，20mmol/L dNTP 2μL，10μmol/L的上游和下游引物各1μL，cDNA模板1μL，5U/μL DNA聚合酶0.2μL，其余为去离子水；立即用PCR管离心机5000转/min离心15s，以确保反应体系混合完全，减少误差；反应条件为:98℃预变性3min；98℃10s，59℃15s，72℃20s，39个循环；72℃延伸5min，4℃保存；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下比对Marker快速切下含有目的条带的胶条，采用柱式微量琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收；回收产物与pMD19-T载体进行连接，之后转化大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行测序，最终获得基因序列信息。

2.一种权利要求所述方法克隆的桑树花青素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡萄糖醛酸转移酶基因在桑椹种质培育过程中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、桑树供试样本总RNA提取

1)将桑椹组织样品在液氮中研磨至粉末，立即加入1ml Trizol，充分混匀裂解；

2)加入200ul氯仿，用力充分振荡混匀，4℃12000rpm离心10分钟；

3)取上清，加入等体积酚仿，充分振荡混匀，4℃12000rpm离心10分钟；

4)取上清，加入等体积氯仿，充分振荡混匀，4℃12000rpm离心10分钟；

5)取上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃沉淀1小时；4℃12000rpm离心15分钟；

6)弃上清，加0.5ml 75％乙醇，4℃8000-10000rpm 5min；

7)重复上一步骤；

8)弃上清后短暂离心，用移液枪吸干乙醇，真空干燥2min；

9)加20ul RNA-Free water，室温溶解5min，混匀后短暂离心得到RNA溶液；

步骤2、反转录

按照逆转录试剂盒R223说明书，50ng-2ug总RNA建立20μl反应体系；

1)将桑树RNA在冰上解冻；4×gDNA wiper Mix、5×HiScript‖qRT SuperMix‖、RNase-Free ddH₂O在室温15-25℃解冻，解冻后迅速置于冰上；使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心后收集残留在管壁的液体；

2)按照gDNA去除反应体系的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀；简短离心，并置于42℃，孵育2min；然后置于冰上放置；

所述gDNA去除反应体系为：

3)按照反转录反应体系配制混合液，所述反转录反应体系具体为：

组成成分 使用量

gDNA去除步骤的反应液 16μl

5×HiScript‖qRT SuperMix‖ 4μl；

4)充分混匀；

5)50℃，孵育50min；

6)95℃，孵育5min得到的cDNA用于后续实验；

步骤3、基因定量分析及应用

根据克隆得到的桑树MaUGAT基因的序列设计引物，MaUGAT-F2引物序列如SEQ:ID:NO:1-SEQ:ID:NO:2所示；

1)20μl反应体系20μl，具体为：

2)反应条件

95度预变性90s，95度变性5s，60度15s，72度20s，40个循环，72℃延伸5min，4℃保存；

3)熔解曲线分析：温度65℃-95℃；

步骤4、数据计算

实验按照2^-△△Ct方法处理数据；其中，△Ct＝目的基因平均Ct-内参平均Ct；△△Ct＝待测样品中目的基因△Ct-参照样品中目的基因△Ct；

△Ct mean＝AVERAGE所有样本复孔Ct值；

Ct SD＝STDEV所有样本复孔Ct值；

Error＝SE Ct sample