[发明专利]一种转基因修饰的Daudi细胞及其制备方法、应用

说明书

本发明提供了一种转基因修饰的Daudi细胞，修饰有目标基因片段，所述目标基因片段表达mbIL‑21。以灭活的所述转基因修饰的Daudi细胞作为滋养细胞，与单个核细胞共培养得到的NK细胞时，扩增倍数达到1500倍以上；CD3^‑CD16⁺CD56⁺的频率大于90％以上，培养所得的NK细胞纯度更高，对K562或其他癌细胞系有细胞毒作用。

技术领域

本发明涉及基因工程和细胞生物学领域，尤其是指一种转基因修饰的Daudi细胞及其制备方法、应用。

背景技术

NK细胞作为固有免疫系统的核心成员，是一群不同于T、B细胞的CD3^-CD56⁺大颗粒淋巴细胞亚群。NK细胞无需抗原致敏就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，而且无MHC限制性，应答速度快，在机体抗肿瘤和抗感染免疫早期即可发挥作用。NK细胞识别“敌”与“我”无需通过抗原克隆，而是通过其表面的活化性受体和抑制性受体进行调节，两者间的平衡及相互作用决定NK的细胞激活及静息。

NK细胞主要来自于外周血中，而外周血中NK细胞仅占单个核细胞的5-20％，这极大限制了NK细胞在临床级别上的使用。因此，有必要建立一种高效扩增NK细胞的体系为过继性细胞免疫治疗铺平道路。

以往的NK细胞扩增方式都是在体外体系中添加细胞因子IL-2，IL-15等促使NK细胞生长，然而这种方法培养出来的细胞数目少纯度低，稳定性也差，且成本较高。最近十年，人们利用基因工程技术将膜结合IL-2，IL-15，IL-18等嵌合到K562细胞上后灭活，以此作为滋养细胞刺激NK细胞增殖，该方法加强了NK细胞特异性增殖，提高NK细胞的活性和存活时间，同时也减少培养时长和降低成本。不过，随着增殖次数的叠加，其端粒逐渐缩短，细胞的扩增能力会有所下滑，从而不能达到临床级别的数量要求。

对于NK细胞来说，IL-21可促进NK细胞增殖分化，并上调其细胞毒活性，还能诱导产生IFN等细胞因子；K562细胞作为目前最为常用的滋养细胞，在培养简便扩增迅速的同时，存在着扩增倍数限制的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：设计一种扩增倍数更优、纯度更高的快速扩增NK细胞的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种转基因修饰的Daudi细胞，修饰有目标基因片段，所述目标基因片段表达mbIL-21。

进一步地，所述目标基因片段还表达IL-15、IL-21、4.1-BBL、CD86、CD314、CD16、IL-18、IL-12、CD14中的一种或几种。

一种转基因修饰的Daudi细胞的制备方法，包括依次执行的以下步骤：

S1：将目标基因片段插入质粒中，得到重构质粒载体；

S2：将所述重构质粒载体重组至慢病毒中，得到重组慢病毒；

S3：通过所述重组慢病毒转染Daudi细胞，得到转基因修饰的Daudi细胞；

所述目标基因片段包含用于表达mbIL-21的核苷酸序列和/或相应的互补序列，所述用于表达mbIL-21的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

进一步地，在所述步骤S2中，所述慢病毒的具体重组方法为：

先按照0.1-0.8×10⁶个/ml的浓度往对数生长期的慢病毒中加入DMEM完全培养基，混匀，置于37℃培养箱中培养，直至慢病毒细胞汇合度达60-70％，得慢病毒悬液；