[发明专利]一种转基因修饰的Daudi细胞及其制备方法、应用

权利要求书

1.一种转基因修饰的Daudi细胞，其特征在于，修饰有目标基因片段，所述目标基因片段表达mbIL-21，所述用于表达mbIL-21的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的转基因修饰的Daudi细胞，其特征在于，所述目标基因片段还表达IL-15、IL-21、4.1-BBL、CD86、CD314、CD16、IL-18、IL-12、CD14中的一种或几种。

3.一种权利要求1或2任一所述的转基因修饰的Daudi细胞的制备方法，其特征在于，包括依次执行的以下步骤：

S1：将目标基因片段插入质粒中，得到重构质粒载体；

S2：将所述重构质粒载体重组至慢病毒中，得到重组慢病毒；

S3：通过所述重组慢病毒转染Daudi细胞，得到转基因修饰的Daudi细胞；

在所述步骤S1中，所述目标基因片段为用于表达mbIL-21的核苷酸序列和/或相应的互补序列，所述质粒为pCDH-WA6299；

在所述步骤S2中，所述重构质粒载体的核苷酸序列为：SEQ ID NO：2，所述慢病毒为293FT细胞。

4.如权利要求3所述的转基因修饰的Daudi细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述慢病毒的具体重组方法为：

先按照0.1-0.8×10⁶个/ml的浓度往对数生长期的慢病毒中加入DMEM完全培养基，混匀，置于37 ℃培养箱中培养，直至慢病毒细胞汇合度达60-70%，得慢病毒悬液；

按照1-6μg/ml的量往所述慢病毒悬液中加入所述重构质粒载体，混匀后，放入37 ℃、5%CO₂培养箱中培养6-12h；弃去旧的DMEM完全培养基，加入新的DMEM完全培养基后再培养24-72h；收集上清液。

5.如权利要求4所述的转基因修饰的Daudi细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述Daudi细胞的具体转染方法为：按照0.2-5×10⁶个/ml的浓度往Daudi细胞中加入无血清培养基，再加入所述重组慢病毒，混合后，在37 ℃、5%CO₂培养箱中培养24-72h，得转基因修饰的Daudi细胞。

6.如权利要求5所述的转基因修饰的Daudi细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所添加的重组慢病毒由所述上清液浓缩后加入1-10倍体积的DMEM完全培养基重悬形成；所述上清液的具体浓缩方法为：将所述上清液过滤至离心管中，在10000-12000rpm条件下离心5-20min，收集沉淀；所述重组慢病毒与所述无血清培养基之间的体积比为1:3-50；所述转基因修饰的Daudi细胞的基因表达在80%以上。

7.一种权利要求1或2任一所述的转基因修饰的Daudi细胞的应用，其特征在于，以灭活的转基因修饰的Daudi细胞作为滋养细胞，应用于NK细胞扩增培养中。

8.如权利要求7所述的转基因修饰的Daudi细胞的应用，其特征在于，所述扩增培养为：按照单个核细胞：滋养细胞=1：0.25-5的数量比例，将单个核细胞和滋养细胞加入至NK细胞培养基中，在37 ℃、5%CO₂条件下进行共培养；

所述共培养方法为：先每隔两天等体积补加NK细胞培养基，直至细胞密度大于A；当细胞密度大于A时，还按照细胞总数：滋养细胞=1-10：1的比例补加滋养细胞；接着每天等体积补加NK细胞培养基，直至第21天停止，其中，A为6×10⁵个/ml。

9.如权利要求8所述的转基因修饰的Daudi细胞的应用，其特征在于，所述转基因修饰的Daudi细胞的灭活方式为：以剂量为50-200 Grays的γ射线辐照15-40min；或以浓度为10mg-200mg/ml的丝裂霉素C筛选30-150min；所述单个核细胞为从外周血或脐血中分离出来的单个核细胞。