[发明专利]一种病原体宏转录组测序文库的制备方法、试剂盒及筛选感染病原体的方法和装置

说明书

本发明实施例提供了一种病原体的宏转录组测序文库的制备方法、试剂盒及筛选感染病原体的生物信息分析方法和装置；本发明实施例提供的宏转录组测序样品的制备方法、试剂盒及筛选感染病原体的生物信息分析方法，利用一次宏转录组测序反应，可同时进行多种潜在病原体的鉴定和宿主免疫响应的表征，综合多维度信息，直接筛选出可能感染的已知或未知病原体，反映病原体与宿主的相互作用，为后续临床诊断提供有力指导。

技术领域

本发明涉及宏转录组测序技术领域，特别是涉及一种病原体宏转录组测序文库的制备方法、试剂盒及筛选感染病原体的生物信息分析方法和装置。

背景技术

临床常见的病原体检测方法有病原体培养、荧光PCR和抗体抗原检测等。一方面，这些技术都需要先验知识，只能检测已知的病原体，具有偏好性；另一方面，这些方法通量较低，可同时检测的病原体种类有限，检测往往需要的较长的时间。基于这些问题，亟需一种全病原体的快速筛选方法，能够通过一次操作就可以直接鉴定出众多已知和未知的病原体，减少检测种类，缩短检测时间，为临床诊断及用药提供指导。

发明内容

本申请的目的在于提供一种病原体宏转录组测序文库的制备方法、试剂盒及筛选感染病原体的生物信息分析方法和装置，以实现感染病原体的快速筛选。

本申请第一方面提供了一种病原体宏转录组测序文库的制备方法，其包括以下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA，通过逆转录获得含有RNA/DNA杂交链的逆转录产物；其中，所述逆转录的反应体系中包含2-3μM的随机六聚体；

(2)将所述RNA/DNA杂交链在打断缓冲液中，在Tn5转座酶复合体作用下打断并接上测序接头后，向反应体系中加入十二烷基硫酸钠，室温孵育3-7分钟终止反应，获得片段化产物；

其中，所述打断缓冲液包括：终浓度为0.8-1.2U/μL RNA酶抑制剂，9-11mM，pH＝7.0-8.0 的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，4-6mM氯化镁，7-9％(w/v)聚乙二醇8000，以及4-6％(w/v) 的聚乙二醇200；所述RNA/DNA杂交链在打断缓冲液中的浓度为0.1-10ng/μL；所述Tn5转座酶复合体包含Tn5转座酶和SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的引物；所述 Tn5转座酶复合体在打断缓冲液中的浓度为1-3ng/μL；所述十二烷基硫酸钠的终浓度为 0.03-0.05％(w/v)；所述打断的反应条件为54-56℃，13-17分钟；

(3)将所述片段化产物进行链延伸以及PCR反应，获得宏转录组测序文库；其中，链延伸采用Bst 3.0DNA聚合酶；PCR采用热启动DNA聚合酶以及SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的引物。

本申请第二方面提供了一种病原体宏转录组测序文库制备试剂盒，其包括：逆转录反应体系、Tn5转座酶复合体、RNA酶抑制剂、打断缓冲液、十二烷基硫酸钠、Bst 3.0DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、PCR反应体系以及SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的引物；

其中，所述逆转录反应体系包含随机六聚体；

所述Tn5转座酶复合体包含Tn5转座酶和SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的引物；

所述打断缓冲液包括：终浓度为0.8-1.2U/μL RNA酶抑制剂，9-11mM，pH7.0-8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，4-6mM氯化镁，7-9％(w/v)聚乙二醇8000，以及4-6％(w/v)的聚乙二醇200。

本申请第三方面提供了一种用于筛选感染病原体的生物信息分析方法，其包括：

(1)采用本申请第一方面提供的方法制备待测样品和对照样品的宏转录组测序文库；