[发明专利]一种病原体宏转录组测序文库的制备方法、试剂盒及筛选感染病原体的方法和装置

权利要求书

1.一种病原体宏转录组测序文库的制备方法，其包括以下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA，通过逆转录获得含有RNA/DNA杂交链的逆转录产物；其中，所述逆转录的反应体系中包含2-3μM的随机六聚体；

(2)将所述RNA/DNA杂交链在打断缓冲液中，在Tn5转座酶复合体作用下打断并接上测序接头后，向反应体系中加入十二烷基硫酸钠，室温孵育3-7分钟终止反应，获得片段化产物；

其中，所述打断缓冲液包括：终浓度为0.8-1.2U/μL RNA酶抑制剂，9-11mM，pH＝7.0-8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，4-6mM氯化镁，7-9％(w/v)聚乙二醇8000，以及4-6％(w/v)的聚乙二醇200；所述RNA/DNA杂交链在打断缓冲液中的浓度为0.1-10ng/μL；所述Tn5转座酶复合体包含Tn5转座酶和SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的引物；所述Tn5转座酶复合体在打断缓冲液中的浓度为1-3ng/μL；所述十二烷基硫酸钠的终浓度为0.03-0.05％(w/v)；所述打断的反应条件为54-56℃，13-17分钟；

(3)将所述片段化产物进行链延伸以及PCR反应，获得宏转录组测序文库；其中，链延伸采用Bst 3.0DNA聚合酶；PCR采用热启动DNA聚合酶以及SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的引物。

2.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述宏转录组测序文库进行XP磁珠纯化。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述病原体包括病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体或寄生虫中的至少一种。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述待测样品包括被病原体感染的宿主的体液、分泌物、排泄物、痰液、肺泡灌洗液中的至少一种。

5.一种病原体宏转录组测序文库制备试剂盒，其包括：逆转录反应体系、Tn5转座酶复合体、RNA酶抑制剂、打断缓冲液、十二烷基硫酸钠、Bst 3.0DNA聚合酶、PCR反应体系以及SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的引物；

其中，所述逆转录反应体系包含随机六聚体；

所述Tn5转座酶复合体包含Tn5转座酶和SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的引物；

所述打断缓冲液包括：终浓度为0.8-1.2U/μL RNA酶抑制剂，9-11mM，pH7.0-8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，4-6mM氯化镁，7-9％(w/v)聚乙二醇8000，以及4-6％(w/v)的聚乙二醇200。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述病原体包括病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体或寄生虫中的至少一种。

7.一种用于筛选感染病原体的生物信息分析方法，其包括：

(1)采用权利要求1-4中任一项的方法制备待测样品和对照样品的宏转录组测序文库；

(2)将所述宏转录组测序文库进行二代测序，获得测序结果的fastq文件；

(3)对fastq文件进行筛选，去除fastq文件中低质量碱基、测序接头序列、长度低于20bp的序列以及宿主核糖体RNA的序列；

(4)从步骤(3)的筛选后的序列中，获得待测样品与对照样品之间差异表达的宿主基因及其功能富集分析结果；

(5)去掉步骤(4)中比对到宿主基因的序列，从剩余的序列中，鉴定待测样品与对照样品中已知微生物的相对丰度及其基因的表达差异；

(6)判定步骤(4)中得到的宿主基因功能富集分析结果中上调基因的功能，与步骤(5)中鉴定到的待测样品中丰度高于对照样品的微生物是否相关，如相关，则判定所述微生物为感染的病原体；

(7)如宿主基因功能富集分析结果中上调基因的功能与鉴定到的待测样品中丰度高于对照样品的微生物不相关，则判定存在未知微生物；

从头组装出未知微生物的基因组，在NCBI NT数据库中搜索与从头组装的基因组相近的物种基因组，以鉴定待测样品中的未知微生物种类，所述未知微生物即判定为感染的病原体。