[发明专利]一种检测临床研究血浆样品中法匹拉韦浓度的方法

说明书

本发明涉及一种检测临床研究血浆样品中法匹拉韦浓度的方法，包括以下步骤：步骤1：血浆样品前处理；步骤2：色谱分离；步骤3：质谱检测。本发明的检测方法具有操作简单、通量高、灵敏度高、精密性和准确性。

技术领域

本发明涉及一种检测临床研究血浆样品中法匹拉韦浓度的方法。

背景技术

法匹拉韦为一种RNA聚合酶抑制剂，具有广谱的抗病毒作用，由日本富士胶片公司开发，2014年3月在日本获批上市，临床用于治疗各类流感病毒。由于其潜在的治疗新型冠状病毒的疗效，2020年2月在中国获批上市。为了支持法匹拉韦的临床研究以及仿制药的研发，需要一种检测人血浆样品中法匹拉韦浓度的方法。目前尚相关技术披露用于检测法匹拉韦在生物基质中的浓度。液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)由于其优异的选择性、灵敏度、通量及适用性被广泛的用于生物基质中药物浓度测定。本发明基于LC-MS/MS技术，开发了检测临床研究血浆样本中法匹拉韦的浓度方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种检测临床研究血浆样品中法匹拉韦浓度的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测临床研究血浆样品中法匹拉韦浓度的方法包括以下步骤：

步骤1：血浆样品前处理，在1.5mL离心管中加入血浆样品，内标溶液，加入甲醇，涡流振荡，离心，取出上清转移至96孔板中，进行LC-MS/MS分析；

步骤2：色谱分离；

色谱条件，色谱柱：Eclipse Plus C18柱，3.5μm，100×4.6mm；进样量：1μL；柱温：40℃；流动相A相选用10mM甲酸铵水溶液含0.3％，流动相B项为甲醇，采用体积比为48：52的A：B相等度洗脱；自动进样器温度为4℃，流动相的流速为：0.65mL/min；

步骤3：质谱检测；

质谱条件：电喷雾电离源；电压为-4500V；离子源温度为500℃；Curtain Gas和CID压力分别为40和9psi；扫描模式为-MRM；监测离子反应分别为：法匹拉韦，m/z 156→m/z113；法匹拉韦-15N3，m/z 159→m/z 115；CE为-23eV；DP为-60V；扫描时间为200ms。

优选地，步骤1血浆样品前处理，取50.0μL血浆样品，分别加入50.0μL内标工作液、200μL甲醇，涡流10min，以4500rpm转速离心10min，取出上清200μL转移至96孔板中，取1.00μL进行LC-MS/MS分析。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明采用简单的蛋白沉淀法处理血浆样品，且没有复杂的浓缩过程，前处理通量较高。

2、本发明检测方法灵敏度较高，浓度为0.0300μg/mL定量下限样品信噪比约为45、检测限经计算约为2.00ng/mL，且色谱进样量仅为1.00μ/L、柱上法匹拉韦的量为5.00pg。

3、本发明针对检测法匹拉韦血浆浓度的方法操作简单、通量高、灵敏度高、精密性和准确性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明法匹拉韦的产物离子全扫描质谱图；

图2是本发明的内标法匹拉韦-15N3的产物离子全扫描质谱图；