[发明专利]提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种提高犬卵巢卵丘‑卵母细胞复合体(Cumulus Oocyte Complexes,COCs)数量的试剂盒及其应用，其试剂盒中添加有苯甲酸雌二醇EB、氯前列醇PGF2α和新型激素制剂FG600三种激素,还建立了一种能在较短时间内使间情期Beagle犬进入发情前期的简易激素诱导方法，此方法能显著提高犬卵巢可用COCs数量，此方法在国内外尚属首次。本发明所述的提高犬卵巢卵丘‑卵母细胞复合体数量的试剂盒在十天内使间情期的犬进入发情前期，通过穿刺法从卵巢回收的COCs数平均58枚左右，显著高于正常发情犬只(平均33.7枚左右)。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种提高犬卵巢卵丘-卵母细胞复合体数量的试剂盒及其应用。

背景技术

Beagle犬是国际公认的实验动物，广泛应用于科学研究的各领域。国内的Beagle犬资源是从国外引进的，目前国外对Beagle的种质资源把控比较严格，因此对国内现有资源的保存和开发显得尤为重要。同时，Beagle犬遗传背景清晰，其基因组与人类相似性高达95.7%，以Beagle犬为实验材料构建疾病模型成为广大学者研究的热点。在犬体外保种工作和疾病模型制备过程中，获得成熟的卵母细胞是至关重要的一步。相对其他哺乳动物而言，由于犬独特的生殖生理特性，其辅助繁殖技术还不成熟。

母犬大部分时间处于发情间期，绝大部分母犬一年只发情1-2次，过长的发情周期制约着犬的生产效益以及育种进度，也影响了疾病模型犬的制备效率。犬排卵时卵母细胞处于生发泡期（Germinal vesicle, GV），需要在输卵管内进一步发育才能成熟。通过手术活体取成熟的卵母细胞需要耗费大量的人力物力，且每头母犬所排卵母细胞有限。如从犬卵巢收集卵巢卵丘-卵母细胞复合体（COCs:Cumulus Oocyte Complexes, COCs）进行体外培养来获得成熟的卵母细胞将极大的提高工作效率。

处于不同发情阶段的犬，其卵巢所能提供的COCs数量差异较大，有研究证明卵泡期能获得的优质COCs最多（22.7枚），黄体期次之（10.7枚），间情期最少（7.3枚）（李继鹏,王锡香, 尹熙俊, 等. 不同生殖周期阶段对犬卵巢卵母细胞体外发育的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2012,39(2):125-128.）。而且对于从不同时期的卵巢中获得的COCs的体外成熟能力在诸多研究中还存在争议（Lopes G, Sousa M, Luvoni G C, et al. Recovery rate,morphological quality and nuclear maturity of canine cumulus-oocyte complexescollected from anestrous or diestrous bitches of different ages[J].Theriogenology, 2007,68(6):825.）。但普遍认为从卵泡期（发情前期/发情期）卵巢获得的COCs比其他生殖阶段获得的COCs具有更高的核成熟潜能。而犬每年只发情1-2次，间情期长达8个月，要想获得卵巢处于卵泡期的母犬并不容易。因此，如能寻找一种快速有效的使间情期的Beagle犬进入发情前期/发情期（卵巢处于卵泡期）的方法，对Beagle犬卵母细胞体外成熟培养以及后续的辅助繁殖技术的探究都具有积极的推动作用，可大大加快重要种质资源体外保存和疾病模型犬构建研究。