[发明专利]Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞系的构建及诱导分化方法

说明书

本发明公开了Keratin 5‑IRES‑eGFP敲入的hESCs细胞系的构建及诱导分化方法。具体方法为：构建sgRNA质粒，根据sgRNA切割位点构建打靶Doner载体，将cas9质粒，sgRNA质粒，打靶Doner载体共电转至hESCs细胞，得到初步阳性单克隆细胞系后电转表达cre酶的质粒，通过PCR跑胶和测序得到最终Keratin 5‑IRES‑eGFP敲入的hESCs细胞系。诱导分化hESCs细胞为角质形成细胞从而得到Keratin 5阳性的基底层角质形成细胞。该细胞系的建立有利于筛选出Keratin 5阳性的基底层角质形成细胞，从而为临床上表皮基底角质形成细胞异常的皮肤病研究提供细胞模型。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及的Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞系的构建方法和应用。

背景技术

人胚胎干细胞(Human embryonic stem cell，hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。在体外或体内环境，hESCs细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。

基底层角质形成细胞(basal keratinocyte)位于表皮最底层细胞，目前认为该类细胞处于分裂活跃状态，经过分化最终变成角质层的无细胞核鳞状细胞，基底层角质形成细胞通过不断地自我更新得以维持表皮的屏障作用。而现有的技术方法难以将基底层角质形成细胞分离培养，使得对其的研究和应用受到限制。

细胞角蛋白(cytokeratin)是上皮细胞中发现的一大类细胞骨架蛋白，是构成生皮表皮、毛皮毛囊的主要蛋白质。角蛋白可保护上皮组织细胞免受损伤或压力。现已发现的角蛋白肽链超过20种，毛角蛋白和表皮角蛋白分别由不同的角蛋白肤链构成。其中角蛋白5(keratin 5)发现在复层鳞状上皮细胞如舌粘膜,以及基底气管上皮细胞,基底层角质形成细胞，毛囊，皮肤的皮脂和汗腺,腔的乳腺细胞等均有表达，基底层角质形成细胞表达角蛋白14(keratin 14)和角蛋白5(keratin 5)，因此角蛋白14和角蛋白5可作为基底层角质形成细胞的标志物。然而现有文献并没有报道相关的利用标志物对基底层角质形成细胞分离培养成功的技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞系的构建方法及诱导分化方法，将该细胞系诱导分化为角质形成细胞后可标记Keratin 5阳性的表皮基底层角质形成细胞，从而通过细胞流式(flow cytometry，FCM)技术将其分选出来。

本发明解决技术问题的方案如下：

一种靶向Keratin 5终止密码子下游的sgRNA，其具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

一对具有与目的基因Keratin 5下游断裂位点上下游相同序列的同源臂，包括与目的基因Keratin 5下游断裂位点上游相同序列的上游同源臂Keratin 5 Arm1，如SEQ IDNO.2所示，以及包括与目的基因Keratin 5下游断裂位点下游相同序列的下游同源臂Keratin 5 Arm2，如SEQ ID NO.3所示。

一种待重组入基因组靶位点的IRES-eGFP，其DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

一种打靶Donor载体Keratin 5-IRES-eGFP-LoxP-neo，其具有与目的基因Keratin5下游断裂位点上游相同序列的上游同源臂Keratin 5 Arm1，以及与断裂位点下游相同序列的下游同源臂Keratin 5 Arm2，上游同源臂、下游同源臂之间是待重组入基因组靶位点的IRES-eGFP的DNA片段，Keratin 5 Arm1的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，Keratin 5 Arm2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，IRES-eGFP的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。