[发明专利]Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞系的构建及诱导分化方法

权利要求书

1.一种诱导Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞分化为基底层角质形成细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建sgRNA质粒，针对目的基因Keratin 5的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入经BsmbI单酶切的pU6-EFsgRNA2.1scaffold载体，筛选后获得sgRNA质粒，确定最高切割活性的sgRNA质粒，sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）构建靶向Keratin 5基因的打靶Donor载体Keratin 5-IRES-eGFP-LoxP-neo，将Keratin 5 Arm1和Keratin 5 Arm2克隆至Donor载体中，得到带有同源臂的Donor质粒，再将IRE-eGFP连至带有同源臂的Donor质粒中，得到打靶Donor载体，为Keratin 5-IRES-eGFP-LoxP-neo；

上游同源臂Keratin 5 Arm1的 DNA序列如SEQ ID NO.2所示，下游同源臂的Keratin 5Arm2的 DNA序列如SEQ ID NO.3所示，IRES-eGFP的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；

（3）将sgRNA质粒,cas9质粒，打靶Donor载体共电转至hESCs细胞，待细胞系稳定后，用1μg/ml的嘌呤霉素筛选2天，培养至细胞系稳定，通过有限稀释法将80个克隆铺于96孔板中，培养半个月后，将挑取的单克隆细胞至24孔板进行培养后，收取细胞提取基因组DNA，随后进行PCR测序初步筛出阳性单克隆并命名为Keratin 5-IRES-eGFP#3；

（4）将初步鉴定为阳性单克隆细胞Keratin 5-IRES-eGFP#3培养至稳定后，电转的方法转入表达Cre酶的质粒，即是pCMV-cre质粒，培养至细胞系稳定，通过有限稀释法将80个克隆铺于96孔板中，培养半个月后，将挑取的单克隆细胞至24孔板进行培养后，收取细胞提取基因组DNA，随后进行PCR测序筛出阳性克隆，将阳性单克隆细胞命名为Keratin 5-IRES-eGFP#3-16；

（5）在分化前3天，将得到的Keratin 5-IRES-eGFP#3-16细胞系铺在Matrigel包被的六孔板中培养，其中加入的培养液为ES培养基，在第0天时，将hESCs细胞移至I型胶原蛋白包被的12孔板上培养，用含有RA和BMP4的DMEM/F12的培养基维持培养，在第8-15天，用含有RA和BMP4的KSFM培养基培养，第15天后，采用含BMP4的KSFM的培养基，持续培养至第30天，此时将hESCs诱导成为表达绿色荧光蛋白的基底层角质形成细胞。

2.根据权利要求1所述一种诱导Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞分化为基底层角质形成细胞的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，sgRNA质粒，cas9质粒，打靶Donor载体电转的数量比例为1:4:10。

3.根据权利要求1所述一种诱导Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞分化为基底层角质形成细胞的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，在分化前3天，将得到的Keratin 5-IRES-eGFP#3-16细胞系铺在Matrigel包被的六孔板中培养，其中加入的培养液为ES培养基，在第0天时，将hESCs细胞移至I型胶原蛋白包被的12孔板上培养，用含有1μM RA和25ng/ml BMP4的DMEM/F12的培养基维持培养，在第8-15天，用含有1μM RA和25ng/ml BMP4的KSFM培养基培养，第15天后，采用含25ng/ml BMP4的KSFM的培养基，持续培养至第30天，此时将hESCs诱导成为表达绿色荧光蛋白的基底层角质形成细胞。

4.一种如权利要求1-3任一所述诱导Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞分化为基底层角质形成细胞的方法得到的细胞。

5.一种如权利要求1-3任一所述诱导Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞分化为基底层角质形成细胞的方法得到的细胞系在制备表皮基底角质形成细胞模型的应用。