[发明专利]一种大肠杆菌菌影的高效制备方法

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，步骤是：制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞；构建含有噬菌体裂解基因E_W及其突变型裂解基因E_M的重组质粒pET21a‑E_W和pET21a‑E_M，再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选，得到重组大肠杆菌；通过优化诱导物IPTG浓度，可以实现在低成本下制备高产量的大肠杆菌菌影，收集菌影、冻干保存。本发明为大规模发酵制备大肠杆菌菌影提供可能，并为其他细菌菌影的研究及制备奠定了基础。

技术领域

本发明属于微生物学和基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌菌影的高效制备方法。

背景技术

菌影(Bacterial ghost)是不含核酸、蛋白质等细胞内容物的完整细菌空壳，菌影保留了细胞壁表面和内膜结构的完整性，其表面的脂多糖等可以作为抗原有效的刺激机体发生体液免疫、细胞免疫以及局部黏膜免疫应答。除此之外，不含细胞内容物的菌影也是良好的递承载体及疫苗佐剂，可以装载大量药物、核酸、抗原等物质，具有良好的应用前景。

菌影是通过在革兰氏阴性细菌中诱导表达噬菌体裂解基因E的方式制备形成。基因E的裂解功能是在1966年在噬菌体感染大肠杆菌中的一次实验中发现的，之后的研究证明基因E在大肠杆菌中的唯一表达就可以引起大肠杆菌的后续裂解。研究表明，基因E编码一种含91个氨基酸的膜蛋白，其N端的疏水性氨基酸能插入到多种革兰氏阴性菌的细胞膜和细胞壁上，聚集形成40-200nm的特异性跨膜通道。在高/低渗透压的作用下，细胞内容物则通过该特异性通道排出。在电镜下观察，发现E蛋白介导的特异性通道并非在细胞膜上随机分布，而是有规律的集中在细菌细胞的两端或中间。

大肠杆菌BL21(DE3)是使用最广的用于高效表达目的基因的菌株，目的基因被克隆到含有噬菌体T7启动子的载体上，T7启动子由T7 RNA聚合酶识别并调节。调控T7 RNA聚合酶的基因位于染色体上，由lacUV5启动子调控。裂解基因E编码产生的裂解蛋白是一种膜蛋白，研究表明，膜蛋白的过量表达会对宿主菌产生毒性作用，因此影响菌影制备的产量。在众多研究中，许多研究者将裂解基因E克隆在pBV220等其他温控载体，然而，其表达产生的菌影产量低一直是困扰研究者的一个问题。

发明内容

本发明旨在解决传统制备方法产量低的不足，提供一种大肠杆菌菌影的高效制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，包括以下步骤：

(1)制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞；

(2)构建含有噬菌体裂解基因E_W及其突变型裂解基因E_M的重组表达质粒pET21a-E_W和pET21a-E_M，再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选，得到重组大肠杆菌；

(3)将步骤(2)得到的重组大肠杆菌加到含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下震荡培养；次日按体积比1：100转接到新鲜的LB培养基中，加入诱导剂IPTG诱导菌体裂解；

(4)利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数，检测裂解效率最高达99.99％时，收集菌影；

(5)将收集的菌影洗涤、乙醇逐级脱水、临界点干燥，用场发射扫描电子显微镜观察；

(6)将收集的菌影洗涤，再用3％磷钨酸染色，透射电子显微镜观察。

优选的，步骤(1)中，采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。