[发明专利]一种大肠杆菌菌影的高效制备方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞；

(2)构建含有噬菌体裂解基因E_W及其突变型裂解基因E_M的重组质粒pET21a-E_W和pET21a-E_M，再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选，得到重组大肠杆菌；

(3)将步骤(2)得到的重组大肠杆菌加到含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下震荡培养；次日按体积比1：100转接到新鲜的LB培养基中，加入诱导剂IPTG诱导菌体裂解；

(4)利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数，检测裂解效率最高达99.99％时，收集菌影；

(5)将收集的菌影洗涤、乙醇逐级脱水、临界点干燥，用场发射扫描电子显微镜观察；

(6)将收集的菌影洗涤、磷钨酸染色，透射电子显微镜观察。

2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。

3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞的步骤是：挑取大肠杆菌BL21(DE3)pLysS单菌落，接种于5mL含30μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养14h；取2mL种子液加入100mL新鲜LB培养基，扩大培养2-3h，测OD₆₀₀的值，当OD₆₀₀约0.4-0.5时停止培养；菌液冰上放置30min，无菌条件下移入预冷的50ml离心管中，4℃、4000rpm离心10min；弃上清，在冰上加入8mL预冷的无菌CaCl₂轻摇使细菌悬浮，冰浴30min；4℃、3500rpm离心5min，弃上清，用1mL预冷的无菌CaCl₂重浮细菌，分装到预冷的无菌EP管中，每管100μL，-80℃保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组质粒pET21a-E_W和pET21a-E_M的构建方法如下：

(2.1)从NCBI上下载得到噬菌体裂解基因E，即野生型裂解基因E_W；根据密码子的偏好性以及二级结构的筛选，得到突变型裂解基因E_M；根据裂解基因E_W和E_M以及质粒pET21a的序列，结合RF克隆的方法，设计上下游引物，引物序列如下：

(2.2)配制PCR体系，以合成的E_W和E_M基因为模板进行基因扩增，PCR体系及程序如下：

取3μL PCR扩增产物进行电泳分析；纯化回收，得到目的基因；

采用RF线性扩增的方式以pET21a质粒为模板，以上述回收的PCR产物为引物进行线性扩增，PCR反应体系如下：

线性扩增反应完成后，用Dpn I酶消化体系中未甲基化的模板质粒，程序如下：

体系配制完成后，在37℃条件下，酶切1h；

(2.3)将反应完成的产物立即转化到大肠杆菌DH5α感受态中，以氨苄青霉素作为抗性筛选；次日，挑取大小均匀的淡黄色菌落经PCR扩增后，将阳性克隆子测序；经过序列比对，正确的阳性克隆质粒即为构建成功的重组质粒，命名为pET21a-E_W和pET21a-E_M。

5.根据权利要求4所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(2.3)中，将产物转化至DH5α感受态细胞时采用的转化方法为热激法。