[发明专利]一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用

说明书

本发明提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用，该方法主要包括：先利用高孔隙率精准微孔滤膜对样本中的背景细胞和稀有目标细胞分别实现初次高效率去除与回收；再利用与背景细胞特异结合的免疫磁珠对背景细胞进行再次去除；最后，再次利用微孔滤膜对稀有目标细胞进行回收和富集。本发明提供的“先滤膜过滤，再磁珠负选”的方法，在实现背景细胞最大限度去除，保证稀有目标细胞高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度分离与富集的同时，降低了免疫磁珠用量及经济成本。因此，本发明提供的方法，不仅操作流程简单、集成度高，避免了离心、液体转移等造成的细胞活性降低；而且经济成本低、装置便携，应用范围广、潜能大。

技术领域

本发明涉及生物医学基础研究及临床医学领域，特别是涉及一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的重大医学问题，2015年中国恶性肿瘤流行情况分析指出，我国平均每分钟有7人被诊断为肿瘤，4人死于肿瘤。近年来，液体活检已发展成为癌症精准医疗的关键技术之一。从液体中分离富集稀有细胞的液体活检技术在癌症早期检测和动态预后监测中具有巨大的应用前景。液体活检方法主要可分为基于物理性质分离和基于生物亲和性分离两类。基于物理性质的稀有目标细胞分离方法可以保留稀有目标细胞的异质性，并且能够实现全部稀有目标细胞的富集。其中，基于尺寸分离的微孔过滤法已被公认为有望实现高通量分离，满足处理实际临床样品需求。然而，由于稀有目标细胞与其他血细胞在尺寸上有一定重叠，使得通过微孔过滤法富集液体中稀有目标细胞纯度较低。

目前，逐渐有研究者将基于生物亲和性分离和尺寸分离相结合，通过复合方式扬长避短，提高稀有目标细胞的分离富集效果。如在专利CN104178454A分离富循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)过程中，先通过免疫磁珠法去除大部分白细胞，再基于尺寸进行过滤式富集。该方法虽然提高了富集效率(富集效率80％)，对白细胞的去除效率99.9％，但由于血液中白细胞数量(～10⁷/mL)相对于CTC(1～10/mL)较多，导致最终得到的CTC悬液纯度依然较低。假设5mL血液样本中含有5×10⁷个白细胞，50个CTCs，通过上述方法进行CTC富集后即使白细胞去除效率99.9％，相较于50个CTCs，最终CTC悬液中白细胞(5×10⁴)残留较多，阻碍对细胞提出高细胞活性和高纯度要求的下游分析。同时，由于血液中白细胞数量较多，富集过程中需消耗大量生物亲和性磁珠，经济成本高，在实际应用中仍有很大局限。

稀有细胞的单细胞组学分析、肿瘤类器官培养及药物耐药性分析等近年来发展迅速。从复杂液体样品中高效地分离、富集稀有目标细胞是下游平台精准检测和分析的关键前提。与传统分离方法(连续稀释法、显微操作法、激光捕获显微切割术、拉曼镊技术、微流控技术、荧光激活细胞分选术)相比，通过先进微纳米技术分离与富集得到的稀有细胞有望实现高细胞活性、高通量、高灵敏度、高纯度等优点，满足下游单细胞组学分析对样品的要求。以单细胞转录组测序为例，细胞纯度和活性是保证分析质量的关键。

综上，亟需一种高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度、强普适性、低成本的稀有目标细胞分离与富集方法。

发明内容

为解决上述背景技术中存在的问题，本发明提供了一种高细胞活性稀有目标细胞分离与富集的方法，该方法将基于物理尺寸差异分离的微孔滤膜法和基于生物亲和性的免疫磁珠负选法进行综合，并基于微孔滤膜法对提纯后的稀有目标细胞进行富集，通过该方法可实现对稀有目标细胞的高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度、强普适性、低成本的分离与富集。