[发明专利]一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用有效
申请号: | 202011483579.3 | 申请日: | 2020-12-15 |
公开(公告)号: | CN112608820B | 公开(公告)日: | 2022-04-15 |
发明(设计)人: | 王玮;刘姚萍;许清梅 | 申请(专利权)人: | 北京大学 |
主分类号: | C12N5/09 | 分类号: | C12N5/09;C12M1/12;C12M1/42;C12M1/00;C12N5/071;C12N5/0786;C12N1/14;C12N1/20;C12Q1/04;C12Q1/02 |
代理公司: | 北京润泽恒知识产权代理有限公司 11319 | 代理人: | 莎日娜 |
地址: | 100871*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 细胞 活性 稀有 分离 富集 方法 装置 应用 | ||
1.一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法,其特征在于,所述方法包括:
步骤1,通过表面功能化修饰的微孔滤膜,在重力作用下过滤,对复杂液体样品进行分离,使得稀有目标细胞被俘获于微孔滤膜;所述复杂液体样品包括稀有目标细胞和背景细胞;其中,所述表面功能化修饰的微孔滤膜,具有超薄结构、超大面积、大的厚/宽比、超高孔隙率,超大面积为大于20 mm×20 mm,大的厚/宽比为10 μm / 4 μm,超高孔隙率为大于50%;所述表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的直径,根据所述稀有目标细胞的直径确定,所述微孔滤膜的相邻膜孔间的连接部分的最大距离小于所述背景细胞直径的一半;
步骤2,激活俘获有稀有目标细胞的微孔滤膜的表面功能化修饰层,使得所述微孔滤膜上的稀有目标细胞被释放/回收到预处理后的低吸附样品管中,得到初级稀有目标细胞悬液;
步骤3,基于生物亲和性原理负选去除所述初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞,得到次级稀有目标细胞悬液;
步骤4,通过所述表面功能化修饰的微孔滤膜,对所述次级稀有目标细胞悬液中的稀有目标细胞进行回收、释放与富集,得到稀有目标细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述表面功能化修饰的微孔滤膜包括微孔滤膜基体和表面功能修饰剂;
所述表面功能修饰剂附着在所述微孔滤膜基体的表面。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,制备所述微孔滤膜基体的材料包括聚对二甲苯、硅、氮化硅、钯、SU8和聚二甲基硅氧烷中的任意一种;
所述表面功能修饰剂为具有生物兼容性好、易于可控切换的材料,包括聚乙烯醇、海藻酸凝胶、明胶、胶原中的任意一种;其中,所述可控切换是指结构或性能可切换,包括聚合大分子溶解成小分子、固态相变为液态、亲水性切换成疏水性中的任意一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的形状包括:正六边形、圆形、正四边形、正三边形中的任意一种。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法,其特征在于,所述表面功能化修饰的微孔滤膜,是按照以下步骤获得的:
步骤S11,通过表面功能修饰剂溶液润湿载破片,并将微孔滤膜基体放置于所述润湿后的载玻片上;
步骤S12,通过旋涂的方式,在所述微孔滤膜基体的表面,覆盖所述表面功能修饰剂溶液,得到表面功能化修饰的微孔滤膜初品;
步骤S13,室温晾干所述微孔滤膜初品,得到表面功能化修饰的微孔滤膜。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述步骤2之前,所述方法还包括:
对用于存放所述稀有目标细胞悬液的样品管进行预处理;所述预处理包括:基于低吸附处理试剂,对所述样品管的内壁进行表面低吸附处理;
其中,所述低吸附处理试剂包括:全氟辛基三氯硅烷、牛血清白蛋白、聚乙二醇、聚乙烯醇中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述基于生物亲和性原理去除所述初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞,包括:
通过具有生物亲和性的免疫磁珠,进一步去除所述初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞;
其中,所述生物亲和性的免疫磁珠是指:偶联有与所述背景细胞进行特异性结合的生物亲和性分子的免疫磁珠;
所述生物亲和性分子包括抗体、核酸适配体中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述复杂液体样品包括:人或动物的血液、尿液、肺泡灌洗液、胸水、腹水、脑脊液或痰液中的任意一种;
所述复杂液体样品中的稀有目标细胞包括:肿瘤细胞、上皮细胞、巨噬细胞、胞外囊泡、细菌或真菌中的任意一种。
9.一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的装置,其特征在于,所述装置包括:表面功能化修饰的微孔滤膜,一体化芯片,磁铁,注射泵;
所述装置用于执行上述权利要求1-8中任意一项所述的高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法。
10.一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法的应用,其特征在于,将上述权利要求1-8任意一项所述的方法,应用于从含有背景细胞的复杂液体样品中提取稀有目标细胞;或
将上述权利要求1-8任意一项所述的方法,应用于制备待检测的细胞样本。
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