[发明专利]一种2A肽、双顺反子表达载体、重组蛋白表达系统及应用

说明书

本发明涉及一种2A肽、双顺反子表达载体、重组蛋白表达系统及应用。本发明提供了一种2A肽(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)，提供了含有所述2A肽编码基因的双顺反子表达载体及其构建方法，并通过构建含有所述2A肽的重组蛋白表达系统，将其应用于重组蛋白的表达，可以实现2个目的基因在哺乳动物细胞的高效表达。试验证明，在同等条件下，与其他2A肽比较，本发明提供的基于E2A和F2A的重组蛋白表达系统能够显著提高哺乳动物细胞重组蛋白的稳定表达水平，可广泛应用于制备各种目的蛋白，特别是抗体的制备。为改善哺乳动物细胞表达系统，进一步提高重组蛋白的表达量、增强细胞株的稳定性、降低生产成本奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种2A肽、双顺反子表达载体、重组蛋白表达系统及应用。

背景技术

重组蛋白是应用基因工程技术产生的蛋白质，近年来，重组蛋白已经成为生物制品的重要组成部分，在生物制药、临床诊断、科学研究中发挥着重要作用。重组蛋白的生产主要包括四大系统：原核蛋白表达，酵母蛋白表达、昆虫细胞蛋白表达及哺乳动物细胞蛋白表达。哺乳动物细胞生产的重组蛋白质能够进行正确折叠、装配和翻译后修饰，具有与人源蛋白分子结构更为接近的优势，因此哺乳动物细胞已经成为蛋白药物的主要表达宿主。目前近80％批准上市的重组蛋白药物均来自于哺乳动物细胞，其中应用最广泛的是人胚胎肾细胞293(human embryonic kidney cells 293)细胞和中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamster ovary cells，CHO)。但与大肠杆菌等表达系统相比，哺乳动物细胞的表达水平仍较低、获得高表达工程细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本较高。这就需要改善哺乳动物细胞表达系统，进一步提高重组蛋白的表达量、增强细胞株的稳定性、降低生产成本的同时确保产品的质量和安全。

目前，常用的表达载体主要有单顺反子载体、核糖体进入位点(internalribosome entry site,IRES，IRES)或2A肽介导的双顺反子载体或多顺反子载体。在生产抗体或多个蛋白时，如果使用单顺反子载体，由于抗体含有重链、轻链多个基因，载体需要多个表达框，造成载体片段过大，构建困难，另外由于不同表达框的表达的蛋白的不平衡，导致抗体产生聚体，影响抗体的质量，选择IRES或2A肽介导的双顺反子载体可以避免这一问题。和IRES相比，2A肽介导的二个基因表达量更高。2A肽是存在2个蛋白之间的寡肽，通常为18-22个氨基酸，当核糖体到达2A的C端最后两个氨基酸Gly-Pro时，由于核糖体酰胺中心内部结构的改变导致无法翻译下游基因，此时上游初生肽被水解释放出核糖体，然后核糖体再翻译下游基因，理论上可以实现两个基因的等量表达，因此2A肽更适合用于构建双顺反子载体，但目前报道的2A肽介导的双顺反子载体的目的基因表达水平较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种2A肽，该2A肽能用于提高哺乳动物细胞重组蛋白表达水平。

本发明的第二个目的在于提供上述2A肽介导的双顺反子表达载体。

本发明的第三个目的在于提供上述2A肽、重组表达载体的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种重组蛋白表达系统，包含上述表达载体，能够提高哺乳动物细胞目的蛋白表达水平。

本发明的第五个目的在于提供上述重组蛋白表达系统的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种2A肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，所述2A肽编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明第二方面提供包含上述2A肽编码基因的双顺反子表达载体。