[发明专利]一种识别PAM序列为NRTH的SpCas9n变体及相应碱基编辑系统

说明书

本发明公开了一种识别PAM序列为NRTH的SpCas9n变体及相应碱基编辑系统。本发明的SpCas9n变体融合ABE的碱基编辑系统入生物体或生物细胞内，使所述SpCas9n变体、sgRNA和ABE的编码基因均得到表达，实现基因组靶点序列的编辑；所述sgRNA靶向所述靶点序列；所述靶点序列的PAM序列为NRTH，N为A、T、C或G；R为A或T；H为A，T或C。本发明利用SpCas9n变体融合ABE的碱基编辑系统在水稻中实现了更多的靶点序列中由A:T到G:C的替换，如PAM序列为NRTH的靶点序列，扩展了ABE介导的碱基替换系统的编辑范围，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种高效水稻碱基编辑系统及应用。

背景技术

越来越多的研究表明，大部分生物性状的改变都存在着相关基因的突变，其中以碱基置换突变即点突变最为常见。寻求高效的单碱基编辑技术一直以来都是植物研究的热点和难点。基因编辑技术CRISPR/Cas9自诞生以来，在基因敲除、敲入、碱基修复等领域得到了广泛的应用。在2017年，刘如谦团队开发出了腺嘌呤碱基编辑器(adenine baseeditors, ABEs)，该工具能够实现腺嘌呤A到鸟嘌呤G的单碱基转换。ABE系统由gRNA和融合蛋白构成，其中，融合蛋白一般由改造的Cas9蛋白(Cas9 nickase, Cas9n)和腺嘌呤脱氨酶组成。其原理为脱氨酶与Cas9切口酶(Cas9n)的N末端融合，在gRNA引导下，使非靶链中的腺苷脱氨，暴露为单链DNA (single-stranded, ssDNA)，然后将腺嘌呤A转化为肌苷I(A-to-I)，最后，DNA聚合酶将肌苷I识别为鸟嘌呤G进行复制，而互补链上原来与腺嘌呤A互补的胸腺嘧啶T将会变成胞嘧啶C，进而完成碱基置换过程。

目前该系统仍然存在一定的缺陷，主要表现为在植物中碱基编辑效率低下。目前有不少研究致力于提升现有的ABE碱基编辑系统的效率，如改变核定位信号的种类和位置、不断升级ABE版本等。但是目前碱基编辑的效率提升有限。而且，基于CRISPR-Cas9系统的一些碱基编辑系统，PAM序列依赖性对靶向范围的限制更大。尽管近些年已经挖掘了很多识别不同PAM序列的Cas9蛋白或者变体用于基因组编辑，使它们识别位点由从NGG扩展到大多数NG位点，但在基因组中缺乏G碱基的位置仍然很难进行靶向编辑。所以有必要提供一种识别更多位点，且高效的单碱基编辑系统，从而拓宽ABE的打靶范围。

发明内容

本发明提供一种能识别非G序列，且高效的碱基编辑系统，要解决的技术问题是如何将生物体或生物细胞中PAM序列为NRTH的靶点序列中的A:T突变成G:C。

为解决上述技术问题，本发明首先提供一种识别PAM序列为NRTH的SpCas9n变体，其特征在于，所述SpCas9n变体包含：

（a）序列表中SEQ ID NO：1所示序列；

（b）在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；

（c）在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者

（d）SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供一种水稻碱基编辑系统，其特征在于，所述水稻碱基编辑系统包括所述SpCas9n变体的编码基因、转录sgRNA的DNA分子以及腺嘌呤脱氨酶ABE的编码基因；

所述sgRNA靶向目标靶点序列；

所述目标靶点序列的PAM序列为NRTH，其中，N为A、T、C或G；R为A或T；H为A，T或C。