[发明专利]一种基于花粉管通道导入的水稻基因定向编辑方法

说明书

本发明公开了一种基于花粉管通道导入的水稻基因定向编辑方法，属于生物技术领域。本发明利用花粉管通道将CRISPR/Cas9载体导入水稻胚囊，实现tms5目的基因的定向编辑。本发明建立的基于花粉管通道的基因定向编辑方法不依赖愈伤组织的遗传转化，并能获得目的基因突变，操作过程简单及可靠。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于花粉管通道导入的水稻基因定向编辑方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，当前，人口增加，耕地减少，环境污染，极端自然灾害频发，水稻粮食安全面临严峻挑战。传统育种技术依赖杂交育种，不能满足性状定向改良，诱变育种又难以做到定点突变。虽然在基因组水平上进行水稻基因人工改造对作物的改良具有重要意义，但一直以来，科学家都未发现有效的植物基因组编辑技术。近年来，最新发现的CRISPR/Cas9技术凭借简单和高效的特点被广泛应用于水稻等作物的基因组编辑中。传统的水稻遗传转化普遍是农杆菌介导法，通过Ti质粒将外源遗传物质整合到受体基因组中。然而，农杆菌介导法对基因型的选择性很强，籼稻相对于粳稻更难转化，且转化周期长，并且该方法需要一套复杂的人工组织培养过程，这都增大了遗传转化的困难性和复杂性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于花粉管通道导入的水稻基因定向编辑方法。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种基于花粉管通道导入的水稻基因定向编辑方法，包括如下步骤：

(1)以水稻tms5基因为基础设计靶序列，所述靶序列SEQ ID No.1为： 5’-GGCGGCGCCATGGCGAACAGCGG-3’；

(2)构建步骤(1)中靶序列的gRNA表达盒；

(3)利用限制性内切酶BsaI和连接酶T4ligase，将双元表达载体pYLCRISPR/Cas9-MT 与上述gRNA表达盒连接后插入双元表达载体中，即得CRISPR/Cas9基因组编辑载体；

(4)将上述编辑载体转化大肠杆菌，之后提取质粒进行验证；

(5)验证正确的质粒采用花粉管通道遗传转化法对水稻进行定向编辑。

进一步的，所述步骤(2)中靶序列的gRNA表达盒的构建过程如下：(1)寡聚核苷酸链引物退火形成双链接头之后，用T4DNA ligase连接至已酶切的U6a-gRNA载体，靶点接头与gRNA载体连接；(2)gDNA表达盒扩增：采用两轮巢式PCR扩增gDNA表达盒，第一轮所用引物为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，第二轮所用引物为SEQ ID No.4-11。

进一步的，所述步骤(5)中花粉管通道遗传转化过程如下：

(1)水稻开花前，选取一个大部分小花正处于花期的穗子，剪去已开过的小花，待大部分小花开过花后，剪去未开的小花，穗子剩下的便是当日刚开的小花，0.5-1.5小时后，剪去内颖的一部分，下剪部位在剪去花柱靠近子房又不伤及子房的位置；

(2)水稻开花后的1.5～3h间进行，选择当天开过的颖花，剔除其他已开和未开的颖花，用镊子从内外颖接缝处至上而下打开，用手固定避免颖壳闭合，剪掉柱头，用微量进样器注入15μl的浓度为1μg/μl质粒DNA以溶液填充籽粒为宜，合上颖壳套袋。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明验证了基于CRISPR/Cas9技术的花粉管通道遗传转化法的可行性，花粉管通道法可作为一项不依赖于农杆菌的遗传转化技术运用到CRISPR/Cas9系统中，且能获得较高的突变效率，操作过程简单。

附图说明

图1为实施例1中扩增gRNA表达盒引物使用流程图。