[发明专利]一种基于花粉管通道导入的水稻基因定向编辑方法

权利要求书

1.一种基于花粉管通道导入的水稻基因定向编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以水稻tms5基因为基础设计靶序列，所述靶序列SEQ ID No.1为：5’-GGCGGCGCCATGGCGAACAGCGG-3’；

(2)构建步骤(1)中靶序列的gRNA表达盒；

(3)利用限制性内切酶Bsa I和连接酶T4 ligase，将双元表达载体pYLCRISPR/Cas9-MT与上述gRNA表达盒连接后插入双元表达载体中，即得CRISPR/Cas9基因组编辑载体；

(4)将上述编辑载体转化大肠杆菌，之后提取质粒进行验证；

(5)验证正确的质粒采用花粉管通道遗传转化法对水稻进行定向编辑。

2.根据权利要求1所述的，其特征在于，所述步骤(2)中靶序列的gRNA表达盒的构建过程如下：(1)寡聚核苷酸链引物退火形成双链接头之后，用T4 DNA ligase连接至已酶切的U6a-gRNA载体，靶点接头与gRNA载体连接；(2)gDNA表达盒扩增：采用两轮巢式PCR扩增gDNA表达盒，第一轮所用引物为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，第二轮所用引物为SEQ ID No.4-11。

3.根据权利要求1所述的，其特征在于，所述步骤(5)中花粉管通道遗传转化过程如下：

(1)水稻开花前，选取一个大部分小花正处于花期的穗子，剪去已开过的小花，待大部分小花开过花后，剪去未开的小花，穗子剩下的便是当日刚开的小花，0.5-1.5小时后，剪去内颖的一部分，下剪部位在剪去花柱靠近子房又不伤及子房的位置；

(2)水稻开花后的1.5～3h间进行，选择当天开过的颖花，剔除其他已开和未开的颖花，用镊子从内外颖接缝处至上而下打开，用手固定避免颖壳闭合，剪掉柱头，用微量进样器注入15μl的浓度为1μg/μl质粒DNA以溶液填充籽粒为宜，合上颖壳套袋。