[发明专利]一种Perakine还原酶突变体及其应用

说明书

本发明提供一种Perakine还原酶突变体及其应用，该突变体由野生型Perakine还原酶氨基酸序列在126位或127位发生以下单突变或126位和127位组合双突变获得：H126G/R/I/C/P/K/N/W/A/Y、R127M/P/N/S/F，其中“/”代表“或”。本发明在晶体三维结构和序列比对基础上，采用定点饱和突变技术对Perakine还原酶行分子改造，筛选获得具选择性还原烯酮双键的突变体。本发明作为催化剂用于选择性还原烯酮双键的方法具反应步骤简单、反应条件温和、环境友好、催化效率高、酶纯化简单、稳定性好、立体选择性强等优点，在烯酮双键还原及相关饱和酮类药物的合成领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于及生物化工技术领域，具体地说，涉及一种Perakine还原酶突变体及其应用，尤其是Perakine还原酶突变体在选择性氢化α,β-不饱和酮双键反应的应用。

背景技术

选择性还原α,β-不饱和羰基化合物的碳碳双键保留羰基是合成饱和羰基化合物的重要手段，在医药化工领域具有广泛的应用，如橙皮苷、姜黄酮及蒲公英黄酮等饱和羰基类天然药物目前主要依靠还原相应的α,β-不饱和羰基化合物获得。然而，采用化学方法进行α,β-不饱和羰基化合物的碳碳双键的还原时，极易与羰基还原发生竞争，实现高区域选择性具有一定的挑战性，目前化学法主要以过渡金属为催化剂实现α,β-不饱和羰基的碳碳双键的选择性加氢反应，但仍存在反应收率和选择性不理想、需要以存在安全隐含的氢气作为氢源、反应条件苛刻及环境污染等问题。

依赖于双键还原酶的生物催化反应是实现碳碳双键还原的另一重要途径，与化学法比，具有高效环保、选择性高、反应温和等优势，但现有的双键还原酶受到其底物谱、酶产量、稳定性、催化效率、辅因子等因素的限制，仍无法实现其在工业化水平的广泛应用，因此，亟需开发可应用于工业化应用的新型高效双键还原酶。

Perakine还原酶(Perakine Reductase，PR)来源于夹竹桃科萝芙木属药用植物蛇根木(Rauvolfia serpentina Benth.ex Kurz)，为醛酮还原酶(Aldo-KetoReductase，AKR)超家族的成员，野生型PR以NADPH为辅酶催化羰基还原反应(Sun L,Ruppert M,SheludkoY,Warzecha H,Zhao Y,J.Purification,cloning,functional expression andcharacterization of perakine reductase:the first example from the AKR enzymefamily,extending the alkaloidal network of the plant Rauvolfia.Plant MolBiol.2008,67(5):455-67.)，可应用于手性醇的合成，具有立体选择性好、转化效率高、反应步骤简单、底物类型多样等特点(孙莲莉，陈媛媛，邵娜娜，周韵，一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，中国专利，ZL201811521466.0；Cai S,Shao N,Chen Y,Li A,Pan J,Zhu H,Zou H,Zeng S,Sun L,*Zhao J.*Enantioselective reduction ofα,β-unsaturated ketones and aryl ketones by perakine reductase.Org.Lett.2019,21,4411-4414.)。AKR超家族成员由醛酮还原酶和双键还原酶组成，通过定点突变催化关键氨基酸可实现羰基还原功能与双键还原功能的转换，由于PR稳定性强、异源表达量高，已基本具备工业化应用的特性，因此，通过定点突变使PR成为高效双键还原酶，有望成为用于选择性氢化α,β-不饱和羰基化合物碳碳双键的候选工业化生物催化剂。

发明内容