[发明专利]一种芝麻离体再生培养方法以及百里香酚作为所用培养基添加剂的应用

说明书

本发明公开了一种芝麻离体再生培养方法，并首次公开了百里香酚作为植物组织培养基添加剂在促进和提高芝麻外植体的愈伤组织诱导及分化率与再生幼苗生根方面的应用。本发明利用含有百里香酚的培养基配方，以芝麻幼苗的子叶作为外植体，建立了一种快速、高效的芝麻离体再生技术体系，解决了目前芝麻组织培养中的外植体容易褐化、培养周期长、重复性差、基因型依赖性强和植株再生频率低等一些突出问题，为芝麻的快速繁殖、种质保存与创新以及转基因技术应用提供了一种简便可靠的技术方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种芝麻离体再生培养方法，本发明还涉及百里香酚作为所用培养基中添加剂的应用。

背景技术

在植物组织培养领域，芝麻是目前公认的属于组织培养困难的几种作物之一，迄今仍面临外植体容易褐化、组织培养周期长、重复性差、基因型依赖性强和植株再生频率低等一系列突出问题，不易获得完整的离体再生植株。因此，芝麻组织培养尚未有效地应用于芝麻的遗传改良，并且以此技术为基础的芝麻转基因研究也受到巨大限制。

目前，国内外虽有少数关于芝麻愈伤组织诱导及分化与植株再生获得成功的公开报道，但人们却很难对这些技术方法进行重复验证，而且植株再生频率也很低，一般仅为0.1%到10%左右。也有报道记载了利用从芝麻种子中剥取的子叶作为外植体进行离体培养，比较容易获得丛生芽的方法，但是该文作者却没有在后续的实践中成功加以应用。鉴于对该技术进行深入研究和应用的需要，当前迫切需要建立一套可靠而行之有效的芝麻离体再生的技术，以便满足芝麻遗传改良和生产发展的需求。

百里香酚(5-methyl-2-Isopropylphenol；或者Thymol)，又名麝香草酚，是一种天然存在于植物中的单萜酚类物质，具有广泛的杀菌、抗氧化、消炎、抗肿瘤和杀虫等活性，常用于制作香料、防腐剂、药物和指示剂等，但在植物组织培养领域中的应用却未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种芝麻离体再生培养方法，为芝麻的遗传改良和进一步研究提供了新的技术思路。本发明还提供了百里香酚在植物组织培养基中的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的一种芝麻离体再生培养方法，其中在愈伤组织的诱导及分化与再生幼苗的生根培养阶段所用的培养基中均添加有百里香酚，其具体培养方法包括下述步骤：

第一步，无菌苗培养

按1L的 1/2MS（Murashige Skoog）培养基中加入30g蔗糖,8g琼脂粉的比例配制生长培养基备用；

选取籽粒饱满的芝麻种子用乙醇和水清洗干净，再用配制的HgCl₂溶液处理，然后用无菌水清洗干净后种植在生长培养基上置于培养室内培养6天，获得无菌苗；

第二步，切取子叶外植体

将第一步获得的无菌苗用手术刀切取子叶外植体，并保留2mm叶柄；

第三步，愈伤组织的诱导及分化

按1L的 MS减铵培养基（这里是指不含硝酸铵的MS基础盐培养基）中加入6-苄基腺嘌呤2mg，萘乙酸0.1mg，百里香酚50 mg，蔗糖30 g，琼脂粉8g的比例，配制诱导及分化培养基备用；

将第二步切取的子叶外植体接种到诱导及分化培养基上，置于培养室内离体培养；培养过程中，首先可观察到外植体明显膨大，然后在子叶柄的伤口处出现愈伤组织，进而可看到分化产生的再生芽；当再生芽长到高度1cm左右时，切除未分化的外植体部分，仅保留带有愈伤组织的再生幼苗继续培养；在整个培养过程中，每两周进行一次继代培养；

第四步，再生幼苗的生根培养

按1L的MS培养基中加入吲哚丁酸0.5mg，百里香酚50mg，蔗糖30g，琼脂粉8g的比例配制生根培养基备用；