[发明专利]基于纳米金的分裂型适体传感器及其制备方法和应用

说明书

本发明属于传感器领域，涉及分裂型适体传感器，特别是指基于纳米金的分裂型适体传感器及其制备方法和应用。本申请基于能量转移原理，利用纳米金淬灭FAM荧光基团；结合分裂型核酸适体识别机制，构建了一种基于纳米金的高灵敏分裂型适体传感器。对传感器制备条件进行实验优化，如AuNPs与P2的结合过程中的柠檬酸钠用量、AuNPs与P2的比例、工作溶液的稳定时间等。利用优化后的工作溶液检测ATP，结果表明该传感器检测范围为30pmol/L到15 nmol/L，高灵敏线性检测范围为30pmol/L到3330pmol/L，检出限为30pmol/L，且具有良好的特异性，是一种极具应用潜力的分裂型适体传感器。

技术领域

本发明属于传感器领域，涉及分裂型适体传感器，特别是指基于纳米金的分裂型适体传感器及其制备方法和应用。

背景技术

三磷酸腺苷(triphosadenine，ATP)是生物体内各种生命活动能量的直接来源，在生化反应和药物分析中起着关键的作用。常见的心血管病、帕金森综合征和阿尔兹海默症都与ATP浓度密切相关，检测ATP浓度在病理和生命科学研究中具有重要意义。传统检测ATP的方法主要依赖于昂贵的仪器设备，如高效液相色谱法、同位素示踪法等，虽然灵敏度较高，但样品制作要求高，实验操作繁琐，仪器昂贵等缺点限制了其推广应用。

核酸适体（aptamer）是指经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段（RNA或DNA），具有易合成、易标记、性质稳定、没有免疫源性和毒性等优势。适配体与靶标结合后，其构象通常发生显著变化，形成发夹、茎环、假结或膨出结构，利用核酸适体与靶标结合后构象变化或结构修饰，结合荧光分析技术的高灵敏性可设计多种荧光适体传感器。但是在复杂的基质中，结构的改变容易受到一些干扰因素的影响，可能产生虚假的阳性或非特异性信号，影响传感器的特异性和灵敏度。为此，Stojanovic等在提出了一种分裂型核酸适体的方法，将核酸适体分裂为两个片段P1和P2，在靶目标存在的情况下形成P1-靶标-P2三明治结构。由于这两个独立的寡核苷酸片段缺乏二级结构，因此不会产生假阳性或非特异性信号。利用分裂型适体设计荧光传感器的方法有很多，You等和Jiang等利用氧化石墨烯或碳纳米管作为淬灭剂，淬灭P1上修饰的荧光信号；加入P2与靶标后，形成P1-靶标-P2三明治结构，荧光恢复，根据恢复荧光信号的多少可测量加入靶标的浓度，ATP检出限为20μmol/L，茶叶碱的检出限为155nmol/L、4nmol/L。Wang M利用纳米金淬灭荧光恢复检测ATP的检出限为5μmol/L。还有人利用无标记的方式结合分裂型适体检测ATP，检出限最低为2.67 nmol/L；将DNA分子设计与核酸外切酶等与分裂型适体结合检测ATP，检出限为1-30μmol/L。分析以上研究发现，分裂型核酸适体检测ATP的检出限一般比较高，不利于低浓度的ATP检测，这是由于核酸适体分裂后，特异性增强，但其与靶标分子的亲和力相对减弱，浓度过低时，由于空间位阻作用，难以将溶液中微量的ATP分子捕获。有研究者通过多种分子修饰（ATP检出限2.4 nmol/L）、化学过程变化（ATP检出限0.02nmol/L）等增强反应过程，有效降低了分裂型适体传感器的检出限，但传感器制备过程复杂，操作难度高且相对成本较高。

发明内容

为解决上述技术难题，本发明提出一种基于纳米金的分裂型适体传感器及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

基于纳米金的分裂型适体传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将核苷酸链P2加入Tris-HCl溶液中反应2h进行激活，得P2溶液；

（2）向P2溶液中加入AuNPs，常温反应20min后，再加入柠檬酸钠溶液并在37℃恒温振荡培养3 h，再离心取底液即得到AuNPs@P2耦合物；

（3）向AuNPs@P2耦合物中加入核苷酸链P1，室温培养2h，即得基于纳米金的分裂型适体传感器工作液。