[发明专利]一种砧木改良方法及应用

说明书

本发明属于生物嫁接技术领域，涉及一种砧木改良方法及应用，包括：步骤1：合成传递基因；步骤2：将合成传递基因与功能基因构建到载体上；步骤3：以农杆菌侵染方式转基因的烟草为砧木，野生番茄为接穗，进行异源嫁接；步骤4：取嫁接口及不同位置茎段及花，提取植物总RNA，反转录成cDNA，RT‑PCR检测SlZFP2‑tRNA^Met和SlZFP2‑3×CTCT等在异源嫁接体系中的运输情况；步骤5：调查转基因砧木上野生型番茄的分枝及开花情况。方法可应用在果树转基因砧木育种中，通过砧木转基因定点高效改良接穗性状，人为操控砧木基因，影响接穗性状，提高调控效率，缩短育种年限，减少人力物力成本，普遍应用于各类植物。

技术领域

本发明属于生物嫁接技术领域，涉及一种砧木改良方法及应用,具体涉及砧穗间长距离传递片段携带功能基因调控接穗农艺性状的方法，更具体涉及的是，通过砧木传递mRNA(信使核糖核酸)片段融合重要农艺性状功能基因遗传转化，进而调控接穗相关性状的技术。

背景技术

嫁接是园艺作物最主要的无性繁殖方式；在嫁接后，砧木与接穗之间相互作用，会影响树体的生长发育、抗性、开花、果实产量和品质等。在实际的生产中，主要是砧木对接穗的调控，选择适宜的砧木是保障果树栽培成功的关键。优良砧木的选用一般通过实生选种、杂交育种和诱变育种等方式获得，后期再通过无性繁殖，保持砧木品种的优良性状(李天忠等在2008提出；沙广利等在2015年提出)，近年来，也有通过基因工程和DNA(脱氧核糖核酸)分子标记技术等方式改良砧木(韩斌等在2014年提出)。然而，以上方式仅能通过天然的人工筛选获得优良砧木，无法定向应用于实际生产中，同时也存在转基因食品不被公众接受的问题。

随着近年来砧穗间传递mRNA的发现，使得砧穗间表型调控机理逐渐清晰，也为定点改良砧木提供理论基础。然而，绝大多数表型相关基因还未知，或者功能基因自身不具有传递性，使得通过砧木定点调控接穗性状的目标难以实现。在对砧穗间长距离运输mRNA的研究中，发现一些特殊结构的mRNA具有较高的传递效率。因此，可以利用上述特殊结构的mRNA具有的传递效率高的特点，并融合不可传递的功能基因，在砧穗间调控性状，从而高效地定点改良砧木。

前期关于传递mRNA携带功能基因的研究较少；在2001年，Kim等将传递基因LeT6与焦磷酸盐依赖的磷酸果糖激酶PFP(PYROPHOSPHATE-DEPENDENT PHOSPHOFRUCTOKINASE)进行融合表达转化番茄，发现番茄叶片由正常叶片转化为鼠耳叶，当把正常叶片番茄嫁接在鼠耳叶番茄上，接穗的叶片也出现了鼠耳叶表型；在2007年，Kudo和Harada在马铃薯上发现，将野生型马铃薯嫁接在引起鼠耳叶性状的番茄上，接穗也会出现鼠耳叶；在2016年，Zhang等将与减数分裂过程相关的功能基因DMC1(DISRUPTION OF MEIOTIC CONTROL1)融合表达可传递基因tRNA^Met转化烟草植株，其上嫁接野生型烟草，将接穗与对照相比，发现：出现了大量败育的花粉，说明RNA(核糖核酸)能够长距离运输到花器官中，并翻译成有功能的蛋白。

虽然关于mRNA携带功能基因调控接穗表型已有相关研究，然而存在对接穗性状调控效果不明显，效率较低，且多数性状不具有产业意义等问题，无法最终应用到砧穗间的重要农艺性状调控的实际生产中。

本发明利用传递效率高的mRNA片段，与产业中不传递的重要农艺性状基因融合表达，构建成mRNA运输载体，通过砧木运输载体遗传转化调控接穗表型，最终达到改良砧木的目的。前期相关技术均存在传递效率低，调控表型不明显，且无法在产业上应用等问题，本发明运用的高效传递mRNA片段可将传递效率提高到90％以上。本发明可应用在果树转基因砧木育种中，解决了通过砧木转基因定点高效改良接穗性状困难的分子育种问题；并通过人为操控砧木基因，影响接穗性状，达到提高调控效率，缩短育种年限，减少人力物力成本的目的；同时避免出现接穗直接转基因等公众不认可，且争议较大等问题，具有能够普遍应用于各种类型植物的特点。

发明内容