[发明专利]一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法

说明书

本发明公开了一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法，属于生物技术领域。本发明公开的一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法，细胞反应板可提前制备，可在‑20℃长期保存；反应结果可用荧光显微镜进行观察。IPMA检测具有特异性强、敏感性高、操作简单的特点；且IPMA方法利用活病毒接种，使用的是全病毒，抗原结构更加完整，结果更具有准确性和代表性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原，PCV2感染后在猪体内引起免疫抑制，常与猪许多病原并发或继发感染，增加了其防制难度。PCV2相关性疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)是一组复杂的、多因子疾病，包括PMWS、猪皮炎与肾病综合症(PDNS)、猪呼吸道综合症(PRDC)等等。目前，对PCVAD的诊断标准、致病机理以及针对病毒本身和PCVAD的防制研究还不十分清楚。基于此，建立快速准确的诊断方法和研究其感染机制对PCV2的综合防控具有重要意义。

因此，提供一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种PCV2的IPMA(免疫过氧化物酶细胞单层试验)中和抗体检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法，具体步骤如下：

(1)将PK15细胞消化离心后制备成含1.0×10⁵cells/mL的细胞悬液，每孔100μL铺到96孔板上，置于37℃5％CO₂培养箱中培养12h，待细胞完全贴壁，将等体积的PCV2病毒液和临床血清37℃孵育1h，然后接种到96孔板内的PK15细胞上，培养48h待细胞长满后取出96孔板；同时设立正常接毒细胞对照孔；

(2)用预冷的无水乙醇固定，加入预冷的无水乙醇，每孔50μL，-20℃放置30min；弃去无水乙醇，PBST清洗，拍干；

(3)加入5％的脱脂奶粉进行封闭，每孔200μL，37℃温箱放置2h；PBST清洗，拍干；

(4)加入PCV2阳性抗体，用PBS按照1:400稀释，每孔加入50μL，37℃温箱放置1h；PBST清洗，拍干；

(5)加入羊抗猪IgG-HRP，用PBS按照1:1000稀释，每孔加入50μL，37℃温箱放置1h，PBST清洗；最后每孔加入PBST50μL，DAB显色5min，终止反应，在倒置荧光显微镜进行观察。

进一步，所述PCV2病毒液的制备方法如下：将临床采集的病料组织进行研磨，按照1mg组织样品加入1mLPBS溶解，反复冻融3次，取上清；12000rpm离心5min，用0.22μm滤器过滤，获得PCV2病毒液。

进一步，所述临床血清的制备方法如下：将采集的血液进行离心，收集血清，用于后期临床血清检测。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种PCV2的IPMA中和抗体检测方法，细胞反应板可提前制备，可在-20℃长期保存；反应结果可用荧光显微镜进行观察。IPMA检测具有特异性强、敏感性高、操作简单的特点；且IPMA方法利用活病毒接种，使用的是全病毒，抗原结构更加完整，结果更具有准确性和代表性。

附图说明