[发明专利]一株高产耐碱脂肪酶的毕赤酵母工程菌

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产耐碱脂肪酶的毕赤酵母工程菌。本发明通过PCR获得来自根霉菌突变菌的耐碱脂肪酶突变基因B‑2，并将B‑2构建到pPIC9质粒上，得到重组质粒pPIC9‑B‑2，并转化到毕赤酵母GS200，筛选得到高表达碱性脂肪酶的重组菌C‑2，其碱性脂肪酶发酵酶活可达85000U/ml。C‑2所表达的碱性脂肪酶在pH 11.5的条件下处理9h，该酶相对活性仍剩余80％左右，具有较好的耐碱性。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高产耐碱脂肪酶的毕赤酵母工程菌。

背景技术：

脂肪酶是能够将长链脂肪酸甘油酯水解为甘油和长链脂肪酸(或逆反应)的生物酶。脂肪酶可在水油界面或者非水溶剂系统中发生酯交换、水解、酯化等化学反应，具有底物专一性和位点选择性等特点。脂肪酶能够应用到油脂加工、食品加工、皮革加工以及饲料和生物能源等行业，具有比较广泛的应用价值。

碱性脂肪酶是在碱性条件下水解脂肪中的酯键的酶，碱性脂肪酶是一种新型洗涤剂用酶，主要用途是作为洗涤剂的新酶种。它的特性能分解衣物油污成甘油二脂、甘油单脂及脂肪酸等较易溶于水的物质，从而显著提高洗衣粉的洗涤效果，尤其是去除黄斑的效果。我们常用各种含酶洗衣粉，其中的酶制剂主要有碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。碱性蛋白酶用于分解蛋白质类污物，如汗渍、血渍等。碱性脂肪酶则主要作用于脂肪酸及其酯类污物，也就是我们通常所指的油污类。

脂肪酶主要来源于植物、动物、微生物，其微生物脂肪酶广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，具有种类多、周期短、繁殖快、易发生遗传变异的特点，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH和底物特异性，其可以在不需要辅酶的条件下催化酯类化合物的水解、醇解、酸解、酯交换及合成等，催化条件温和、能耗低、副产物少，具有高效、高选择性、环境友好等特点，改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件。尽管自然界中有多种脂肪酶可供选择，但这些天然酶往往不能满足生物催化的需求，包括底物选择的范围、pH、温度特性和稳定性(长时间反应的稳定性、有机溶剂耐受性)等。

随着基因工程技术的不断发展，利用基因工程手段结合所需脂肪酶基因构建毕赤酵母工程菌，使其更好的表达，对满足工业生产的需求，降低生产成本具有重大意义。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种耐碱性提高的脂肪酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。所述脂肪酶突变体具体为脂肪酶突变体B-2，来自一株经紫外诱变获得的根霉菌ZF056，将脂肪酶突变体编码基因从ZF056中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母GS200中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。

所述脂肪酶突变体B-2的酶学性质如下：

(1)pH:pH 10.0-11.5酶活稳定，最适作用pH 10.5。

(2)温度：45℃-60℃酶活稳定，最适作用温度为50℃。

(3)耐碱性：该酶在pH 11.5的条件下，9h后酶活力仍存留80％以上。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.脂肪酶突变体的标识

在本发明中，B-1表示野生型脂肪酶，B-2表示脂肪酶突变体，信息如下表。

所述野生型脂肪酶B-1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；

所述野生型脂肪酶B-1编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；

所述脂肪酶突变体B-2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；