[发明专利]单分散羧基胶体碳的制备方法及其在新型冠状病毒抗体检测试纸的应用

权利要求书

1.单分散羧基胶体碳的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、超声处理：取炭黑和超纯水按重量比1:30混合后，设定500-1500W的功率超声处理10-60min，得到炭黑悬浮液；

S2、氧化反应：将氧化剂溶液滴加至所述炭黑悬浮液中搅拌均匀，冷凝回流反应；

S3、离心：将步骤S2所得溶液进行若干次离心，初次离心的参数为3000rpm离心5min；

除最后一次离心以外的每次离心后均去除上清液，取下层沉淀加入与步骤S1等体积的超纯水，设定500-1500W的功率超声处理10-60min；直至最后一次离心后上清液的pH值在6-7之间为止；最后一次离心后去除上清液，取下层沉淀待用；

S4、烘干：取步骤S3所得下层沉淀于60℃烘干，即得到羧基胶体碳的粉末。

2.根据权利要求1所述的单分散羧基胶体碳的制备方法，其特征在于，步骤S2中所用的氧化剂溶液为浓硝酸、高锰酸钾或双氧水溶液。

3.根据权利要求2所述的单分散羧基胶体碳的制备方法，其特征在于，步骤S2的氧化反应具体为：以所述炭黑重量为基准按2.5mL/g的比例取浓硝酸滴加至所述炭黑悬浮液中，加入超纯水定容至步骤S1所述炭黑悬浮液体积的两倍，105℃油浴加热冷凝回流2-8h。

4.根据权利要求3所述的单分散羧基胶体碳的制备方法，其特征在于，步骤S2中，冷凝回流的时间为5h。

5.根据权利要求2所述的单分散羧基胶体碳的制备方法，其特征在于，步骤S2具体为：加热所述炭黑悬浮液至沸腾，以所述炭黑重量为基准按15mL/g的比例取0.05M高锰酸钾溶液滴加至所述炭黑悬浮液中，105℃油浴加热冷凝回流0.5-4h。

6.根据权利要求3所述的单分散羧基胶体碳的制备方法，其特征在于，步骤S2中，冷凝回流的时间为1h。

7.根据权利要求1所述的单分散羧基胶体碳的制备方法，其特征在于，步骤S3的离心中，从第二次离心开始的每次离心的参数都比上一次增加3000rpm，离心时间增加5min。

8.一种新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，包括PVC板，所述PVC板的表面依次粘贴样品垫、结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜、吸收垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述结合垫包被有胶体碳-新型冠状病毒重组抗原复合物和胶体碳-鸡IgY抗体复合物，所述检测线包被有鼠抗人IgG二抗和鼠抗人IgM二抗，所述质控线包被有兔抗鸡IgY二抗；

所述胶体碳-新型冠状病毒重组抗原复合物和胶体碳-鸡IgY抗体复合物是以权利要求1所述单分散羧基胶体碳为载体，分别用新型冠状病毒重组抗原、鸡IgY抗体标记组合而成；所述胶体碳-新型冠状病毒重组抗原复合物包括胶体碳-新型冠状病毒重组N抗原复合物和胶体碳-新型冠状病毒重组S抗原复合物。

9.权利要求8所述的新型冠状病毒抗体检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

P1、新型冠状病毒重组抗原与胶体碳的标记：

P11、制备胶体碳-新型冠状病毒重组N抗原复合物：用5mM，pH＝8.8的硼酸缓冲液配制0.01％的所述单分散羧基胶体碳溶液1mL；加入60μg新冠病毒重组N蛋白，室温震摇60min；再加入100μL的10％BSA溶液，室温震摇10min，再加入10μL的5％PEG20000溶液，室温震摇10min；将上述混合溶液4℃下离心30min，离心参数为10000rpm；取下层沉淀用0.3％pH＝8.0的Tris缓冲液定容至100μL，即为胶体碳-新型冠状病毒重组N抗原复合物，置于4℃保存备用；

P12、制备胶体碳-新型冠状病毒重组S抗原复合物：用5mM，pH＝9.6的碳酸盐缓冲液配制0.01％的所述单分散羧基胶体碳溶液1mL，加入20μg新冠病毒重组S蛋白，室温震摇60min，再加入100μL的10％BSA溶液，室温震摇10min，再加入10μL的5％PEG20000溶液，室温震摇10min；将上述混合溶液4℃下离心30min，离心参数为10000rpm；取下层沉淀用0.3％pH＝8.0的Tris缓冲液定容至100μL，即为胶体碳-新型冠状病毒重组S抗原复合物，置于4℃保存备用；

P2、制备胶体碳-鸡IgY抗体复合物：用5mM，pH＝8.8的硼酸缓冲液配制0.01％的所述单分散羧基胶体碳溶液1mL，加入10μg鸡IgY单克隆抗体，室温震摇60min，再加入100μL10％BSA溶液，室温摇震10min，再加入10μL的5％PEG20000溶液，室温震摇10min；将上述混合溶液4℃下离心30min，离心参数设定10000rpm；取下层沉淀用0.3％pH＝8.0的Tris缓冲液定容至100μL，即为胶体碳-鸡IgY抗体复合物，置于4℃保存备用；

P3、制备新型冠状病毒抗体检测试纸

P31、准备结合垫：将胶体碳-新型冠状病毒重组N抗原复合物、胶体碳-新型冠状病毒重组S抗原复合物和胶体碳-鸡IgY单克隆抗体复合物按5:1:5的比例混合，喷涂于处理好的结合垫上，喷量为2μL/cm；然后37℃烘箱干燥16-24h，加干燥剂密封保存备用；

P32、划线：将硝酸纤维素膜贴于PVC底板上，将1.0mg/mL的兔抗鸡IgY单克隆抗体划于硝酸纤维素膜上的质控线处，将0.8mg/mL鼠抗人IgG抗体、1.0mg/mL鼠抗人IgM抗体划于硝酸纤维素膜上的检测线处，37℃烘箱干燥16-24h，加干燥剂铝箔袋密封保存备用；

P33、组装：将步骤P31所得结合垫、滤血膜、样品垫、吸收垫依次粘贴在已贴好硝酸纤维素膜的PVC底板上，切条、组装、密封，即得新型冠状病毒抗体检测试纸，室温保存备用。