[发明专利]实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的方法及试剂盒

说明书

本发明提供一种实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的方法及试剂盒。其中引物包括正向引物和逆向引物，如SEQ ID NO:2～3所示；探针，如SEQ ID NO:4所示；QPCR模板，如SEQ ID NO:1所示。本发明通过对NCBI数据库中所有HHV7基因组DNA和H gene分离株序列共22个做了同源性比对，设计出1组实时定量PCR的正反向引物以及探针，能够高效、准确的检测出所有类型的HHV7 DNA，并且不受大量背景细胞DNA的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的HHV7病毒污染。

技术领域

本发明所属生物检测技术领域，特别是涉及运用体外核酸检测法检测生物制品中的HHV7病毒污染的方法。

背景技术

人疱疹病毒7型(Human Parvovirus HHV7)于1990年由Frenkel等首次在健康人体外周血活化CD4+T细胞中分离得到，后又在人体的血液和唾液中被分离鉴定。因其基因组与人疱疹病毒6型(HHV6)及人巨细胞病毒(HCMV)约有75％的同源性，故将其归于一疱疹病毒亚科。临床上，HHV7与小儿急疹和玫瑰疹等发病密切相关，并与神经系统病变有一定联系。HHV7引起的原发感染多发生于幼童时期，以引起短暂发热为主，有时可伴皮疹。当器官移植受者体内潜伏的HHV7病毒被激活后，将出现严重并发症。故近来，人们已经认识到HHV7是一种机会性感染病原，对人体健康产生严重影响。

HHV7病毒的检测方法很多，主要包括抗体检测技术、抗原检测技术以及核酸检测技术。抗体检测技术不适用于培养细胞的检测；抗原检测技术检测灵敏度较低。核酸检测技术适用范围广，且灵敏度较高，是HHV7检测的一种较好的选择。该检测技术主要包括核酸分子检测技术和核酸分子扩增检测技术两种。

目前，常用的核酸检测技术为实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)法。该方法指在PCR扩增过程中，通过荧光信号的强弱，对PCR产物进行实时检测，从而快速、高效、准确的检测出HHV7基因组DNA。检测生物制品中的HHV7病毒的方法需要尽可能多地覆盖HHV7的变异株。目前文献公开的HHV7病毒qPCR检测方法均不能保证覆盖所有类型的HHV7。

因此，本领域需要提供一种准确的检测出所有类型的HHV7 DNA的方法，并且该方法不受大量背景细胞DNA的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种能高效、准确的检测出所有类型的HHV7DNA且不受大量背景细胞DNA的影响的检测HHV7病毒的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的方法，按以下条件进行:

1)提取待测样品总DNA；可将总DNA的浓度调整为0.1μg/μL；

2)制备反应体系，每份反应体系包括预混液、一对引物及相应的探针；所述预混液为TaqMan Universal Master Mix；所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列为：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC(如SEQ ID NO:2所示)，所示反向引物的核苷酸序列为：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG(如SEQ ID NO:3所示)；所述探针的核苷酸序列为：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ(如SEQ ID NO:4所示)；