[发明专利]一种γδT细胞的制备和扩增方法以及应用

说明书

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及外周血来源γδT细胞的分离及扩增方法。本发明提供了一种分离、扩增和修饰体外扩增γδT细胞的体外方法，包括：获取或者分离γδT细胞；和/或在存在含有唑来膦酸、人重组白细胞介素2(IL‑2)和人重组白细胞介素7(IL‑7)的情况下培养介质中扩增所述分离的γδT细胞。本发明还提供了使用嵌合抗原受体修饰γδT细胞，及其在用于制备抗肿瘤及抗艾滋病制品中的应用。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及γδT细胞的分离，制备，扩增和应用。本发明还涉及外周血来源的γδT细胞的分离和扩增方法，γδT细胞体外基因修饰的方法，修饰后的γδT细胞在抗肿瘤领域的应用。

背景技术

目前，用于癌症的T细胞免疫疗法不断发展并取得良好的临床疗效。但是仍然存在异体化治疗的障碍。γδT细胞发挥杀伤活性时不需要特异性抗原的刺激，无主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制性，具有较好的抗肿瘤活性和多种生物学功能，是肿瘤细胞免疫治疗强有力的工具。

根据T细胞受体(TCR)的不同，人体T淋巴细胞分为αβT细胞和γδT细胞。αβT细胞是体内主要的免疫T细胞，具有主要组织相容性复合体(MHC)介导的特异性识别抗原细胞毒功能。近年来具有非MHC限制性的γδT细胞开始逐渐受到了科研工作者的重视。正常情况下，γδT细胞约占外周血T细胞总数的5％以下，主要分布于皮肤、小肠、食管、肺、生殖器官等，为非特异性免疫细胞。γδT细胞作为重要的效应性T细胞，可分泌重要的杀伤肿瘤细胞的细胞因子，如干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素(IL)一17A，从而具有较强的杀伤活性。

盐焗显示，当所述的γδT细胞被工程化以表达嵌合共刺激受体时，它们可以特异性地识别肿瘤细胞靶标，从而特异性杀伤靶细胞。并且，与基于单一抗体的CAR不能区分表达靶抗原的肿瘤和健康细胞相比，基因修饰后的γδT细胞不存在肿瘤脱靶(on-target/off-tumor)毒性的风险，其次，与受限于抗原非依赖性(强直)信号传导的CAR-T细胞相比，基因修饰后的γδT细胞具有更强的增殖能力，并不容易衰竭。

迄今为止，常用扩增方法如IL-2，IL-15，IL-18等培养化合物成分扩增γδT细胞，该方法在14天内可使总γδT细胞增加100-1000倍；此后，扩增率降低，这与细胞死亡的增加相一致。因此，传统γδT扩增方案无法产生足够数量的细胞以符合商业上可行的同种异体产品。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供大量、快速的扩增人外周血来源的γδT细胞的方法。

本发明的另一个目的是制备具有靶向杀伤肿瘤细胞作用的γδT细胞。

本发明的再一个目的是提供上述γδT细胞的应用。

一方面，本发明提供了分离和扩增γδT细胞的方法，包括从人受试者的血液样本中分离γδT细胞，在存在唑来膦酸和细胞因子组合物的情况下扩增分离得到的γδT细胞，可扩增倍数达到1500倍。

本发明提供了一种体外扩增γδT细胞的方法，所述的方法包括：

获取或者分离γδT细胞；和/或

在含有唑来膦酸、人重组白细胞介素2和人重组白细胞介素7的培养介质中扩增所述的γδT细胞。

较好的，所述γδT细胞使用磁珠分离。

较好的，其中活扩增的培养介质(培养基)中存在唑来膦酸，浓度为0.5-2.0μM。

较好的，培养介质(培养基)中还白介素，其中存在的IL-2的浓度为5ng/ml至10ng/ml。较好的，还可以包括IL-7，IL-7浓度为0.5-5ng/ml。