[发明专利]一种产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种基于复合碳源代谢分工产N‑乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用。通过构建强化N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径，并敲除6‑磷酸果糖激酶基因，定向点突变甘油激酶表达基因，对甘油葡萄糖复合碳源的利用进行了代谢分工，使葡萄糖主要用于目标产物N‑乙酰氨基葡萄糖的生产，甘油主要用于细胞生长，以提高N‑乙酰氨基葡萄糖的合成效率。混合碳源培养基摇瓶发酵48h后N‑乙酰氨基葡萄糖的产量最高达到107.8g/L，复合碳源转化率最高达到49％，相比于葡萄糖利用菌株，产量提升了151.7％，转化率提升了60.2％，具有较强的工业化生产潜力。

技术领域：

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种基于复合碳源代谢分工产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用。

背景技术：

N-乙酰氨基葡萄糖是一种功能单糖，对于骨关节的修复与保健，缓解骨关节炎具有重要的作用，因而，作为保健品与药品具有广阔的市场应用需求。传统的生产方法主要为从虾壳蟹壳中经过酸水解进行提取，存在环境污染、易致敏等问题。近年来，随着代谢工程的迅速发展，微生物发酵法进行N-乙酰氨基葡萄糖生产的报道不断涌现。目前，已经实现了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等微生物的发酵生产。N-乙酰氨基葡萄糖的生物合成过程需要以糖酵解途径中的6-磷酸果糖为前体物，因而合成过程与细胞生长代谢形成竞争关系，限制了N-乙酰氨基葡萄糖的转化率。

随着生物柴油工业的蓬勃发展，大量的粗甘油出现剩余，作为廉价碳源，具有丰富的来源。本发明通过构建N-乙酰氨基葡萄糖生产菌大肠杆菌，并敲除pfkA基因，阻断糖酵解过程，对碳代谢过程进行分工，利用甘油作为廉价碳源，用于细胞生长，使葡萄糖能够更加高效地用于N-乙酰氨基葡萄糖的合成，显著提高了合成的效率与转化率。

发明内容:

本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于复合碳源代谢分工产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，以及利用所述工程菌生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

本发明将提供的技术方案之一：是一株基于复合碳源代谢分工生产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌基因工程菌，所述的基因工程菌株是以大肠杆菌为宿主，表达glmS基因，以及Sc-gna1基因，构建N-乙酰氨基葡萄糖的合成通路，构建无质粒系统，利用木糖启动子(P_xylF)诱导来自T7噬菌体的RNA聚合酶基因，结合T7强启动子系统启动目的基因表达。同时对糖酵解过程中6-磷酸果糖激酶基因进行定点敲除，并且引入文献报道(Pettigrew:Asingle amino acid change in Escherichia coli glycerol kinase abolishesglucose control of glycerol utilization in vivo.J Bacteriol,1996,178(10):2846–2852)的大肠杆菌甘油激酶基因glpK*(G913A)实现复合碳源的代谢分工。

所述产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，包含T7启动子控制的来自E.coli K-12MG1655菌中的glmS，以及来自酿酒酵母的Sc-gna1基因；大肠杆菌甘油激酶突变基因glpK*；木糖启动子控制的来源于T7噬菌体来源的RNA聚合酶基因(T7RNAP)；以及nagA、nagB、nagC、nagE、manX、manY、manZ、nanE、pfkA九个基因缺陷型。

所述编码基因Sc-gna1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示；

所述编码基因glmS的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所示；

所述编码基因nagA的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3所示；

所述编码基因nagB的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.4所示；

所述编码基因nagC的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5所示；

所述编码基因nagE的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.6所示；