[发明专利]SMIM26作为结核病诊断分子标识的用途

权利要求书

1.检测分子标记物SMIM26表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。

2.检测SMIM26蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物SMIM26表达水平方法为荧光定量PCR法。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物SMIM26表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核病为肺结核或肺外结核。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该试剂盒还包括如下组分：

特定细胞富集抗体标记磁珠，Dynabeads CD15(Invitrogen，US)；细胞总RNA提取试剂盒，RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)；cDNA反转录酶，SuperScript^TMIVVILO^TMMaster Mix(Invitrogen，US)；qPCR荧光定量PCR检测体系，包括TaqManTM FsatAdvanced Master Mix(Thermo Fishen Scientific,US)，TaqAssay SMIM26外显子区域特异性检测引物及探针。

8.SMIM26在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。

9.SMIM26在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以SMIM26作为诊断分子标记物。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1)全血样本处理

吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，

2)磁性分离

⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；

⑵加入1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清，

⑶从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次，

⑷加入350μL的Buffer RLT裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用，

3)总RNA提取

采用RNeasy Plus Mini Kit对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取，具体操作如下：

⑴配制反应体系1和反应体系2

将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中，12,000rpm离心30s；

⑵向流穿液中加入350μL 70％乙醇，混匀，转移700μL至RNeasy Mini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑶加入700μL Buffer RW1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑷加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑸加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min，

⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL水，静置1min，12,000rpm，离心1min，所得RNA冰上放置备用，

4)cDNA的合成

取细胞总RNA，采用SuperScript^TMIV VILO^TMMaster Mix进行反转录，得到细胞样本cDNA，

5)实时荧光定量PCR检测SMIM26基因的相对表达量

采用上步骤中制备的cDNA为模板，对SMIM26特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中SMIM26基因的相对表达量。