[发明专利]一种α-糖苷酶基因突变体及在制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用

说明书

本发明公开了一种α‑糖苷酶基因突变体及在制备2‑O‑α‑D‑葡萄糖基‑L‑抗坏血酸中的应用，所述α‑糖苷酶基因突变体是将第270位酪氨酸突变为苯丙氨酸，或/和将第373位色氨酸分别突变为亮氨酸，或/和将第411位甲硫氨酸突变为苯丙氨酸，或/和将第491位精氨酸突变为赖氨酸，或/和将第504位色氨酸突变为亮氨酸所得。该突变体制备简单，实现了催化生成AA‑2G的产量的提高。相同条件下，突变体比活力较原始酶明显提高，催化生成AA‑2G的产量最高可达18.9 g/L，产AA‑2G的转化率较原始酶有显著的提高。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，特别涉及一种来源于Oryza sativa的α-葡萄糖苷酶突变体在制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）中的应用。

背景技术

L-抗坏血酸(又称维生素C，VC)是一种人体自身不能合成的水溶性维生素，参与体内多种生理活动个，如促进胆固醇转变为胆汁酸，促进肾上腺皮质激素的合成，参与芳香族氨基酸的代谢，促进铁的吸收及参与体内多种氧化还原反应等，在维持和促进人体健康中扮演着重要的角色。然而其C-2位上的羟基极不稳定，在氧、热、光、重金属等条件下非常容易发生氧化降解，导致其生理活性减弱甚至消失，从而极大的限制了其应用。

上个世纪以来，开发既保证VC正常生理功能又稳定的VC衍生物成为国内外学者研究的热点，目前主要的VC衍生物有金属盐类、酯类及糖基类衍生物。与VC其他的衍生物相比，2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）稳定性强，安全性高，生产方法简单，进入机体后，可以在α-葡萄糖苷酶的作用下缓慢分解成VC与D-葡萄糖，这种缓释作用能长效保持VC在体内发挥正常的功能，是最佳的VC替代品，目前被广泛应用于食品、化妆品、医疗保健等行业。

利用糖基转移酶的特异性转糖基作用进行生物转化合成是目前维生素C葡萄糖苷的唯一生产途径。目前所报道的AA-2G生物催化用酶主要有α-葡萄糖苷酶（EC 3 .2 .1.20，α-Glucosidase）、环麦芽糊精葡聚糖转移酶（EC 2 .4 .1 .19，CyclomaltodextrinGlucanotransferase，简称CGTase）、α-淀粉酶（EC 3 .2 .1 .1，α-Amylase）、蔗糖磷酸化酶（EC 2 .4 .1 .7，Sucrose phosphorylas）、葡聚糖蔗糖酶（EC 2 .4 .1 .5，Dextransucrase）、α-异麦芽糖基葡糖基形成酶等六类酶。1990年，NorioMuto等首次发现大米来源的α-葡萄糖苷酶能够以成本较低的麦芽糖为糖基供体，特异性催化L-AA合成AA-2G。但相关研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用α-葡萄糖苷酶突变体制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）的方法，实现生物法一步催化转化高效生产AA-2G，具有产物单一易于分离纯化的特点。

本发明采用的技术方案是：

一种α-葡萄糖苷酶突变体在制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）中的应用，所述α-葡萄糖苷酶突变体以来源于Oryza sativa（UniProtKB登录号：Q653V7）的α-葡萄糖苷酶（其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示）为亲本，并对其进行一个或多个氨基酸的突变所得。

本发明所述的α-葡萄糖苷酶突变体包括与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列≥95％同源性(优选地，≥96％的同源性；更优选地≥97％的同源性；最优选地，≥98％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；以及将SEQ ID NO .1中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的多肽。