[发明专利]分离检测叶酸中叶酸及叶酸光学异构体的方法

说明书

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种分离检测叶酸及其光学异构体的方法，该方法采用的色谱柱是以硅胶表面共价键合O‑9‑(叔丁基氨基甲酰)奎宁为填料，采用有机溶剂、有机酸和三乙胺进行梯度洗脱，将叶酸和/或叶酸光学异构体进行分离；流动相流速为0.4～0.6ml/min；色谱柱柱温为20～30℃；检测器波长设定为280±10nm；使用的稀释剂为四氢呋喃、甲醇、水、醋酸、三乙胺的混合溶液，利用峰面积归一化法测得叶酸及其光学异构体的含量。该方法叶酸及其光学异构体出峰时间快，20分钟内即可完成，峰型对称，能将其从多种杂质中分离出来，得到准确的含量，方法简单、快速、有效。

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种HPLC法分离检测叶酸中叶酸及叶酸光学异构体的方法。

背景技术

叶酸是一种水溶性维生素，分子式是C₁₉H₁₉N₇O₆,分子量441.40,化学名为N-[4-[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶)甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸。因绿叶中含量十分丰富而得名，又名喋酰谷氨酸。在自然界中有几种存在形式，其母体化合物是由喋啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸3种成分结合而成，其结构式如下：

叶酸呈黄色或橙黄薄片状或针状晶体，无臭无味，加热至约250℃，色渐变深，最后成黑色胶状物。不易溶于水和乙醇，易溶于酸性或碱性溶液。抗贫血药，对正常红细胞形成有促进作用。在茶树物质代谢中，参与甲基的传送。也参与体内氨基酸及核酸合成，并与维生素B12共同促进红血球的生成。用于各种巨幼红细胞性贫血，尤适用于孕妇及婴儿巨幼红细胞性贫血。但在制药领域，制备叶酸时会出现多种杂质，其中一种为叶酸的光学异构体，化学名为(2R)-2-[4-[[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢蝶啶-6-基)甲基]氨基]苯甲酰胺基]戊二酸，分子式为C₁₉H₁₉N₇O₆，分子量为441.40，结构式为：

上述物质为叶酸光学异构体，性质和结构都存在相似，其分离难度更大，而目前也并没有相关技术披露可以将其从众多杂质中进行分离，所以分析叶酸光学异构体仍是一个技术问题，对于相关药物的分析存在阻碍。

发明内容

有鉴于此，本发明目的之一是提供一种利用高效液相色谱法将叶酸和/或叶酸光学异构体从叶酸粗品中分离出来的方法，该方法可有效快速的将叶酸及其光学异构体与相关杂质进行分离。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

从叶酸及相关杂质中分离叶酸和/或叶酸光学异构体的方法，所述方法采用的色谱柱是以硅胶表面共价键合O-9-(叔丁基氨基甲酰)奎宁为填料，采用流动相A和流动相B将所述叶酸和/或叶酸光学异构体从所述叶酸及相关杂质中进行分离；所述流动相A为有机溶液；所述流动相B为有机酸和三乙胺的混合溶液；所述相关杂质为杂质A～I、杂质SM1d、杂质SM1k、叶酸光学异构体中的一种或多种；所述叶酸和相关杂质的结构式如下：

杂质I：EP标准中注明为未知结构，但有关物质中有检出，无法得到标准品，在本方法中不在光学异构体位置出峰，不干扰光学异构体杂质检测。

进一步，所述流动相A与流动相B的体积比为80～120:4～8。

进一步，所述有机溶液为甲醇和乙腈的混合溶液，其体积比为40～60:40～60。

进一步，所述流动相B为醋酸和三乙胺的混合溶液，其体积比为2～4:2～4。

进一步，所述流动相流速为0.4～0.6ml/min。

进一步，所述色谱柱柱温为20～30℃。