[发明专利]结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针

说明书

本发明公开了一种结核分枝杆菌实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域。本发明提供的试剂盒包括核酸提取液、检测液a、检测液b和SAT酶液等，其中核酸提取液中包含优化设计的特异性捕获探针提取探针，可以对预处理后的试样中的靶标核酸进行有效富集提取和纯化，结合分步添加的检测液a、检测液b和SAT酶液，可以实现对结核分枝杆菌的高灵敏度检测。

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及其专用引物和探针，尤其涉及使用特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Test，SAT)检测样本中结核分枝杆菌(Tuberculousbacillus，TB)核酸的试剂盒及其专用引物和探针。

背景技术

结核分枝杆菌感染人体导致的结核病是严重影响人类生命健康的一种传染病，可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，结核分枝杆菌不仅感染人，哺乳动物也可以发生感染，人与动物之间除了靠空气中的气溶胶传播外，一些动物产品如肉、乳、动物皮毛等也是动物传染给人的主要传播途径，对结核分枝杆菌的检测能准确识别传染源和传染路径，另一方面，还有助于对可能由病菌污染的环境，例如河水、污水、物体表面附着物等，以及饮用水、食品等样本进行监测。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处在于：前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，因此无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。SAT技术已由申请人申请专利并授权(ZL200810111479.0)，然而，SAT技术在不同种类病原体的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病原体的特性进行专门设计。利用SAT技术对结核分枝杆菌进行核酸扩增检测已由申请人申请专利并获得授权(ZL201110137694.X)，但是在该专利文献的检测方法中，向预处理后的试样中一步加入用于检测结核分枝杆菌的引物和探针，可能会造成不同引物和探针之间的相互干扰，以及试样中存在的较多杂质的干扰，造成检测灵敏度的降低；另外，该专利文献在利用SAT技术扩增检测结核分枝杆菌核酸之前，采用NaOH溶液对样本进行预处理，会导致结核分枝杆菌死亡，造成RNA降解，从而出现假阴性结果并降低检测灵敏度；并且结核分枝杆菌对NaOH具有一定耐受性，这增加了操作人员的感染风险。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括：

(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物和提取探针，其中所述特异性捕获探针用于捕获检测序列，所述提取探针用于与靶标序列特异性结合；

(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；

(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；

(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；

其中所述特异性捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述提取探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述靶标检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

上述试剂盒还包括：

(5)样品预处理液：其包含胍盐、去垢剂和巯基还原剂中的至少一种；