[发明专利]产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了产L‑苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明通过强化L‑苏氨酸生产菌株的生物素合成，尤其是pyc基因得到强化的菌株，采用的具体手段为强化bioABFCD基因(包括启动子强化、RBS序列强化、多拷贝)，解除birA基因转录阻遏，以及强化bioABFCD的同时解除birA转录阻遏。构建得到的产L‑苏氨酸的基因工程菌，经发酵培养，L‑苏氨酸产量可达20.2g/L，糖酸转化率可达23.8％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。

随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering ofEscherichia coli for L-threonine production,Mol Syst Biol.2007；3:149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。CN105543156A通过强化thrA*BC、敲除tdh获得MHZ-0213-3菌株，该菌株苏氨酸产量为4.2g/L、转化率约为8.9％，且无质粒负担。CN106635945A通过在大肠杆菌中强化pntAB基因和异源引入pyc基因获得MHZ-0215-2菌株，该菌株苏氨酸产量为12.4g/L、转化率约为16.2％且无质粒负担。其中pyc基因编码的丙酮酸羧化酶PCx可将丙酮酸催化生成苏氨酸合成的前体草酰乙酸。丙酮酸羧化酶的分子量为520000Da，由四个相同亚基组成，每个亚基的一个赖氨酸残基共价连接一个生物素辅基，生物素作为PCx的辅因子是丙酮酸羧化所必需的。但当pyc基因表达量进一步增加时，丙酮酸羧化酶的辅因子生物素不足将会大大限制改造菌株转化率的进一步提升。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

本发明构思如下：本发明以MHZ-0215-2为出发菌株(参见ZL201611250306.8)，根据大肠杆菌中L-苏氨酸的代谢路径及出发菌株MHZ-0215-2的遗传背景，在其基因组上进行相关改造，强化菌株的生物素合成。具体包括生物素合成路径中关键基因的强化和过表达，例如，将生物素合成操纵子bioABFCD的表达加强，包括用强启动子替换原有启动子，或者增强RBS的强度以及在基因组上增加bioABFCD的拷贝数；解除BirA(DNA结合转录阻遏物/生物素-[乙酰-CoA-羧化酶]连接酶)对生物素合成操纵子bioABFCD的转录阻遏；另外，将上述两种改造方式组合，协同增加丙酮酸羧化酶(pyc基因编码)的辅因子生物素的供应，以进一步提高菌株生产苏氨酸的能力。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供产L-苏氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌选自A～C中的任一种：

A、通过增强大肠杆菌中编码NCBI参考序列NC_000913.3(807968..812947)的基因bioABFCD，获得的基因增强菌株；