[发明专利]一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法

权利要求书

1.一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)产妇筛查；

2)样本采集；

3)样本检测；

4)样本预处理；

5)细胞分离制备；

6)原代培养；

7)传代培养；

8)细胞检测；

9)细胞冻存；

10)建立可供检索的细胞信息档案；

11)编码入库并上传细胞信息档案。

2.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中产妇筛查为取5ml产妇外周血及5ml脐血进行病原微生物检测。

3.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中样本采集包括如下步骤：

1)在距脐带两端2-3cm处结扎；

2)剪下结扎好的脐带置于装有30-50ml储存液的采集瓶中；

3)将去掉脐带后的胎盘置于装有400-600ml储存液的采集盒中。

4.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中样本预处理包括如下步骤：

1)将样本在生理盐水中洗净残血；

2)用75％医用酒精消毒浸泡；

3)再用生理盐水漂洗2-3次。

5.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中的细胞分离制备，包括如下步骤：

1)将预处理后的新鲜胎盘胎儿面，光滑面朝上，以脐带根部为中心划十字切口，剥离羊膜；

2)将羊膜用生理盐水清洗干净，沥干水分；

3)用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内；加入含有5-20倍体积的0.05％-0.25％的酶消化10-120min后，加入5-10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min洗涤，去除上清后再用生理盐水离心洗涤两次，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min；

4)剥离羊膜后，分离绒毛膜，将剥离的绒毛膜再次用生理盐水清洗干净，沥干水分；

5)用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内；加入含有5-20倍体积的0.05％-0.25％的酶消化10-120min后，加入5-10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，按照1：(1-3)的比例加入到分装好的淋巴细胞分离液中，离心机升1降1，1000-2000rpm，4℃离心20分钟，取中间白膜层及以上细胞组织，再用生理盐水离心洗涤两次，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min；

6)将预处理后的脐带样本用手术剪剪成小段，再次用生理盐水清洗干净，剥取华通氏胶，用眼科弯剪剪碎呈肉糜状。

6.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤6)中原代培养包括如下步骤：

1)用间充质干细胞原代培养液重悬处理好的组织块或细胞后接种至培养皿中，间充质干细胞原代培养液没过细胞或组织块2-5mm；

2)放置37℃，5％CO₂培养箱中培养，每隔3天观察一次，每隔5-7天根据细胞爬出情况补液或者换液。

7.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤7)中传代培养，包括如下步骤：

1)去除培养液，加入适量生理盐水清洗1-3次，彻底去除残留的组织块；

2)加入1-5ml干细胞温和酶干细胞温和酶或胰酶室温消化1-5min后，加入5倍体积生理盐水终止消化；

3)收集细胞悬液1200-1700rpm离心3-15min弃上清液，所得细胞沉淀记为P0代细胞；

4)将P0代细胞接种至含20-25ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入CO₂浓度5％，温度37℃培养箱中培养中继续培养；

5)待细胞增殖融合度达到85-95％后，按照上述处理步骤进行消化收集得到P1代细胞，即为种子细胞。