[发明专利]一种广谱荧光底物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种广谱荧光底物，其特征在于：该广谱荧光底物为具有如下结构通式(Ⅰ)的卤代苯乙基-4-羟基1,8-萘酰亚胺衍生物中的一种：

其中，R₁选自F、Cl、Br或CF₃中的一种。

2.一种如权利要求1所述的广谱荧光底物的制备方法，其特征在于步骤如下：

⑴将4-溴-1、8-萘酸酐和苯乙胺衍生物在乙醇中溶解混匀，反应并回流8小时后冷却至室温，倒入冰水中，分离出沉淀物，用水洗涤、干燥；

其中，4-溴-1、8-萘酸酐和苯乙胺衍生物的摩尔比为：1∶1.2；

其中，步骤⑴所述的苯乙胺衍生物为对氟苯乙胺、对溴苯乙胺、对氯苯乙胺和对三氟甲基苯乙胺中的一种；

⑵将步骤⑴所得产物和碳酸钾在甲醇中混合回流10小时，冷却至室温后，加入浓盐酸将pH值调节至1-2，过滤沉淀物，用水洗涤并干燥；

其中，步骤⑴所得产物和碳酸钾的摩尔比为：1∶9；

⑶将步骤⑵所得产物和吡啶盐酸盐溶解在环丁砜中，加热到200℃，反应8小时后冷却，将混合物倒入水中，分离出沉淀物，用水洗涤，干燥即得所述广谱荧光底物；

其中，步骤⑵所得产物和吡啶盐酸盐的摩尔比为：1∶20。

3.一种如权利要求1所述的广谱荧光底物的应用，其特征在于步骤如下：

(1)将三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液与MgCl₂，目标UGT酶，广谱荧光底物溶液、抑制剂混合,反应温度为20-60℃,pH值在5-10，预孵育3-5分钟；

(2)将不同浓度的抑制剂与步骤(1)所得的混合溶液混匀，设置空白对照组，在37℃孵育3-5分钟；

(3)在步骤(2)所得的混合溶液中加入尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，反应10-60分钟；

(4)在步骤(3)所得的混合溶液中加入冰乙腈，在离心机上以20,000×g，4℃的条件下离心20分钟，反应液离心沉淀蛋白后，用过液相-荧光检测系统定量分析，荧光检测条件为：激发波长分别为450nm，360nm；发射波长分别为560nm,450nm；

(5)定量测定反应时间内葡萄糖醛酸产物的生成速率并计算加入待测抑制剂的反应速率相对于空白对照组反应速率的百分数作为抑制活性评估标准。

4.一种如权利要求3所述的广谱荧光底物的应用，其特征在于步骤(1)中三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的pH＝7.4，目标UGT酶为人肝微粒体，步骤(2)中的抑制剂为尼罗替尼。

5.一种如权利要求4所述的广谱荧光底物的应用，其特征在于步骤(1)中广谱荧光底物浓度为1/10-1K_m，反应温度为37℃，pH为7.4。

6.一种如权利要求3所述的广谱荧光底物的应用，其特征在于步骤(4)中检测条件以十八烷基甲硅烷基柱为固定相，以0.2％甲酸水和乙腈为流动相，0-1min，80％甲酸水，1-2min，80％-60％甲酸水；2-6min，60％-20％甲酸水；6-6.5min，20％甲酸水；6.5-7.5min，20％-80％甲酸水。

7.一种如权利要求1所述的广谱荧光底物的应用，其特征在于步骤如下：

(1)将三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液与MgCl₂，目标UGT酶，广谱荧光底物溶液以及抑制剂在96或384酶标仪孔板上混合,反应温度介于20-60℃之间,孵育体系pH介于5-10之间；

(2)预孵育，将不同浓度的抑制剂与步骤(1)所得混合溶液混匀，并设置空白对照组)，37℃下孵育3-5min；

(3)在步骤(2)所得的混合溶液中加入尿苷二磷酸葡萄糖醛酸后放入酶标仪，反应10-60分钟；

(4)用酶标仪进行实时定量分析检测，荧光检测条件为：激发波长分别为450nm，360nm；发射波长分别为560nm,450nm；

(5)定量测定反应时间内葡萄糖醛酸产物的生成速率并计算加入抑制剂组的反应速率相对于空白对照组反应速率的百分数作为抑制活性评估标准。

8.一种如权利要求7所述的广谱荧光底物的应用，其特征在于步骤(1)中广谱荧光底物浓度为1/10-1K_m，抑制剂为穗花杉双黄酮，反应温度为37℃，pH为7.4。