[发明专利]一种基于ISET原理的循环肿瘤细胞IHC抗原修复方法

说明书

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种基于ISET原理的循环肿瘤细胞IHC抗原修复方法。该方法包括以下步骤：在水浴锅加入0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液，加热至95℃，放入用磁铁固定后的一张循环肿瘤细胞玻片加热15分钟；修复完成后，取出玻片，使用PBS洗2min*3次。本发明提供的抗原热修复后，对循环肿瘤细胞IHC染色效果好，且能够减少因抗原修复造成的假阳性；本发明进一步完善循环肿瘤细胞检测鉴定技术体系。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种基于ISET原理的循环肿瘤细胞IHC抗原修复方法。

背景技术

由于石蜡切片标本多数使用甲醛固定，甲醛在组织中所形成的醛键、羧甲基等封闭了部分抗原决定簇，或由于蛋白分子之间的交联而使抗原决定簇隐蔽。因此在染色前有些抗原需要先进行抗原修复或暴露才能使组织中的抗原抗体充分结合，出现理想的染色结果。而对于需要进行修复的抗原，需在建立染色程序时确定。常用的方法有加热抗原修复法和酶消化法两种。经大量试验验证．加热抗原修复法优于酶消化法，其机制目前仍不清楚，可能是加热打开了组织抗原因甲醛固定所引起的抗原决定簇的交联，因此使免疫组织化学染色的敏感度大幅度提高。石蜡包埋组织会因固定过程中蛋白抗原活性的丢失而导致染色变浅，造成检测结果的假阴性，此外，固定剂的类型等也会影响到染色结果，而抗原修复为了弥补固定过程中抗原活性的丢失，但是，抗原的修复也会造成一定程度的非特异性染色，导致检测结果的假阳性。现有技术中，尚未有针对循环肿瘤细胞进行修复的相关记载。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于ISET原理的循环肿瘤细胞IHC抗原修复方法。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种基于ISET原理的循环肿瘤细胞IHC抗原修复方法，包括以下步骤：

（1）在水浴锅加入0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液，加热至95℃，放入用磁铁固定后的一张循环肿瘤细胞玻片加热15分钟；

（2）修复完成后，取出玻片，使用PBS洗2min*3次。

进一步的，所述枸橼酸钠缓冲溶液的pH值为6.0。

本发明还提供了一种利用上述抗原修复方法修复后循环肿瘤细胞的免疫组化检测方法，包括以下步骤：

1）将修复后的循环肿瘤细胞玻片中滴加100μl 0.1% Triton X-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；

2）滴加100μl 0.3% H₂O₂，室温下孵育10min，PBS洗2min×3次；

3）滴加100μl一抗工作液，室温下孵育2h，PBS洗2min×3次；

4)滴加100μl山羊抗兔/小鼠 IgG/HRP，室温下孵育15-30min，PBS洗2min×3次；

5)滴加100μl DAB显色液，室温下孵育3～10min；

6）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色15min；

7）过水漂洗1秒，盐酸酒精分化3-8秒，自来水返蓝15min；

8）75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，晾干，中性树脂封片。

9）光学显微镜下镜检。

进一步的，步骤3）中，所述一抗工作液为CD45+CD31。

上述一抗工作液具体制备过程为：取100μlCD45一抗工作液，加入1μlCD31一抗浓缩液混匀即可。

进一步的，所述梯度乙醇具体脱水过程为：75%乙醇脱水1min，95%乙醇脱水1min，100%乙醇脱水1min。

本发明具体的实验路线如图1所示。