[发明专利]一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法

权利要求书

1.一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，包括(1)采集产前诊断后剩余羊水细胞、新生儿脐血、脐带和胎盘组织，分离间充质干细胞、羊水成纤维细胞，或以干细胞诱导的方法制备干细胞、肺干细胞；(2)将hTERT和/或SV40LT基因转染干细胞，制备永生化干细胞；(3)敲除永生化干细胞的新冠病毒易感基因hACE2和敲入新冠病毒靶向干扰基因shRNA，制备新冠病毒基因沉默干细胞；(4)将新冠病毒抗体产生基因S1-RBD插入所述基因沉默干细胞DNA，制备RNA干扰干细胞载体疫苗；(5)将新冠病毒易感基因hACE2和新冠病毒靶向干扰基因shRNA敲入同一永生化干细胞，制备DNA重组干细胞；(6)将新冠病毒抗体产生基因S1-RBD插入所述DNA重组干细胞，制备DNA重组干细胞载体疫苗；(7)将所制系列干细胞及其载体疫苗按供者姓名、ABO血型或HLA分型集中收藏于-196℃液氮，建立可再生利用的新冠肺炎个体化治疗专用干细胞库，当新冠病毒流行时可从预备的干细胞库中提取各分型干细胞或其疫苗进行培养扩增，遵从患者自身或同型干细胞选用原则。

2.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，所述新冠病毒靶向干扰基因包括新冠病毒M、N、S和/或E基因。

3.根据权利要求1、2所述的一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，所述新冠病毒M、N、S和/或E基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。

4.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，扩增所述hACE2基因的上游引物为：CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3；下游引物为：EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin的上游和下游引物分别为：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。

5.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，所述永生化干细胞的hACE2基因敲除指构建CRISPR-Cas9质粒pX330-ACE2并转染永生化干细胞，实现hACE2基因敲除。

6.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎防治干细胞库的构建方法，其特征在于，所述DNA重组干细胞载体疫苗的构建方法，包括以下步骤：

(1)获得间充质干细胞：从产前诊断后剩余的羊水细胞、绒毛细胞以及出生后的脐带、胎盘组织中获得间充质干细胞，或经干细胞诱导获得所需干细胞。

(2)给干细胞装配永生化基因：构建携带hTERT和/或SV40LT的重组载体，转染干细胞，使hTERT和/或SV40LT整合到干细胞DNA，制备能无限传代的永生化干细胞或肺干细胞。

(3)给干细胞装配新冠病毒易感基因：将血管紧张素转换酶II(ACE2)基因重组到慢病毒表达载体pGC-FU中，构建重组质粒pGC-FU-ACE2，将该质粒和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)共转染293FT细胞，包装携带ACE2的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使干细胞DNA整合上ACE2基因，以增强干细胞的病毒易感性，使之更易与宿主细胞竞争将nCoV吸入干细胞内进行RNA干扰，以减少正常宿主细胞的病毒感染机会。

(4)给干细胞装配新冠病毒RNA干扰基因：设计和优选新冠病毒靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒LV3载体，构建重组质粒LV3-nCoV-shRNA，将重组质粒和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使干细胞获得能干扰nCoV在干细胞内复制的功能。

(5)制成一种人工装配永生化基因、新冠病毒RNA干扰基因和易感基因从而兼具干细胞固有治疗功能、人工永生化功能、新冠病毒RNA干扰功能和易感特性的DNA重组干细胞。

(6)给干细胞装配抗体表达基因：根据GenBank分析SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列，根据S1-RBD氨基酸序列(Gly319～Asn541)，采用氨基酸密码子同义置换，合成RBD肽段对应核酸的全基因序列，在序列两端分别插入HindIII和Xho I的酶切位点，将合成的RBD基因构建重组质粒pGC-FU-RBD，将重组质粒和包装质粒共转染293FT细胞，包装携带RBD的慢病毒，将慢病毒转染DNA重组干细胞，使RBD基因整合到DNA重组干细胞DNA，从而获得能通过表达RBD蛋白刺激宿主产生相应抗体的DNA重组干细胞载体疫苗。

(7)按姓名、ABO血型或HLA分型收藏于干细胞库，当新冠病毒流行时，可取各型DNA重组干细胞载体疫苗进行培养扩增，按自身或同型使用原则选用，进行个体化治疗。